来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母基因编辑，曾是分子生物学实验室里最考验耐心的手艺活之一。传统的CRISPR-Cas9流程依赖限制性内切酶和连接酶把向导RNA（sgRNA）克隆进质粒，步骤多、周期长，每换一个编辑靶点就得重新克隆一次。Rostamian等人近期在《STAR Protocols》发表了一套简化方案，用PCR扩增直接完成向导序列的安装与Cas9质粒的无缝环化，把原本数天的克隆流程压缩到一天之内。这套方法不仅降低了技术门槛，还让向导的迭代测试变得像换引物一样简单。
研究背景
CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母中的应用早已成熟，但一个常被低估的瓶颈在于sgRNA表达质粒的构建。传统路线需要设计并合成互补的寡核苷酸，经过磷酸化、退火、酶切、连接、转化等多个步骤，才能把向导序列装进质粒。每一步都有失败的可能，且一旦靶点效果不理想，整个流程需要重来。
Rostamian等人提出的策略绕开了酶切连接：通过PCR引物直接在质粒上安装sgRNA序列，同时利用同源重组实现质粒的环化。整个流程不需要限制性内切酶，不需要T4连接酶，只需要一次PCR和一次转化。质粒带有KanMX/G418筛选标记，既能在大肠杆菌中扩增，也能在酵母中筛选。论文还配套设计了HDR供体DNA的构建方案，以及LiAc/PEG共转化酵母的操作细节，形成了一套从设计到验证的完整工作流。
研究方法
这套协议的核心思路，是把sgRNA的安装从“克隆”变成“PCR”。研究者设计了两段PCR引物，其中一段在5'端携带靶标特异的guide序列，通过PCR扩增将这段序列引入质粒骨架。PCR产物两端带有同源臂，转化大肠杆菌后利用体内同源重组完成质粒的环化，实现无缝拼接。整个过程不需要酶切位点的设计，也不需要体外连接。
论文给出了完整的培养基配方与试剂配制方案。LB液体培养基使用25 g/L的预混LB肉汤粉，121°C高压灭菌20–30分钟，冷却至约55°C后加入过滤除菌的卡那霉素储备液（50 mg/mL），终浓度为50 μg/mL。含卡那霉素的LB液体培养基在4°C可保存1个月，不含抗生素的版本室温可保存6个月。LB琼脂平板额外加入1.5%（w/v）的Bacto琼脂，121°C灭菌至少20分钟，冷却至55°C后加入卡那霉素并轻轻旋动混匀，避免产生气泡，随后倒入无菌培养皿，室温凝固后倒置保存于4°C，同样可存放1个月。
酵母培养方面，YPD液体培养基的配方为2%（w/v）葡萄糖、2%（w/v）蛋白胨、1%（w/v）酵母提取物，用ddH2O定容至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温可保存6个月。YPD+G418琼脂平板在YPD基础上加入2%（w/v）Bacto琼脂，高压灭菌后加入G418储备液（50 mg/mL），终浓度为500 μg/mL。
sgRNA与HDR供体的设计是这套流程的关键环节。论文指出，guide序列需针对靶位点设计，同时要确保Cas9切割效率。HDR供体则需包含与基因组靶位点两侧同源的序列，用于引导修复。供体设计中还建议引入沉默突变破坏PAM序列，防止编辑后Cas9反复切割已修复的位点——这是提高编辑成功率的重要细节。
质粒构建的具体操作是：以Cas9-sgRNA质粒为模板，用携带guide序列的引物进行PCR扩增。PCR产物直接转化大肠杆菌，利用菌体内同源重组完成质粒环化。随后挑取单克隆，提取质粒进行测序验证，确认sgRNA序列正确插入。整个克隆环节不需要限制性内切酶和连接酶，这是与传统方法最大的区别。
酵母转化采用醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）共转化法。将验证正确的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA一同转入酵母感受态细胞。论文未详述LiAc/PEG转化的具体参数（如醋酸锂浓度、热激温度与时间），但强调共转化后需在YPD培养基中恢复培养，再涂布到含G418的YPD平板上进行筛选。G418（Geneticin）对应质粒上的KanMX标记，只有携带质粒的酵母才能在该平板上生长。
筛选过程中，“CRISPR + HDR供体”实验组与“无修复对照（–HDR供体）”组的菌落数量对比，是判断转化和切割是否成功的初步指标。Cas9切割基因组后，若没有修复模板，DNA双链断裂无法修复，细胞将死亡。因此无供体对照组只能长出少量菌落，而实验组应长出大量菌落。这种“多对少”的对比，直观反映了guide RNA是否有效介导了靶位点的切割。
菌落PCR是验证编辑结果的常规手段。论文建议挑取6–8个菌落，用跨越同源臂两侧的引物进行菌落PCR。正确编辑的克隆应扩增出预期大小的片段。插入或缺失会导致条带相对未编辑对照发生位移，点突变则需要通过DNA测序确认。测序应覆盖编辑位点的连接处，验证设计的基因型是否准确，包括供体中引入的沉默PAM突变。
质粒消除是编辑完成后的收尾步骤。编辑成功的酵母克隆在非选择性培养基（YPD）中传代培养后，部分细胞会自然丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过将克隆分别点在YPD和YPD+G418平板上，可以在YPD上生长但无法在G418平板上生长的克隆即为已消除质粒的菌株。这一步骤为后续无需筛选标记的菌株应用提供了便利。
研究结果
论文报告了该协议在实际应用中的预期结果。在LiAc/PEG转化和恢复培养后，YPD+G418平板筛选能够富集携带KanMX标记的CRISPR质粒的酵母。30°C培养2–3天后，“CRISPR + HDR供体”条件通常能产生大量菌落，而“无修复对照”组仅产生少量菌落。这一对比说明两个问题：一是转化和筛选体系工作正常，二是所选guide RNA能够有效介导靶位点的切割——因为Cas9切割是致死性的，没有修复模板的细胞无法存活。
菌落PCR筛选6–8个克隆时，正确编辑的克隆应扩增出预期大小的片段。删除和插入突变会显示相对于未编辑对照的条带位移，点突变则需要测序确认。论文指出，成功的实验中，至少一部分被筛选的菌落应为PCR阳性，且跨越连接处的DNA测序应确认设计的基因型，包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。
质粒消除实验的结果同样明确：在非选择性培养基中传代后，部分编辑克隆会丢失KanMX标记的CRISPR质粒。将这些克隆分别点在YPD和YPD+G418平板上，能够在YPD上生长但无法在G418平板上生长的克隆即为已成功消除质粒的菌株。
这套流程的价值在于，它将sgRNA的构建从多步骤的酶切连接简化为一步PCR，使得快速迭代多个guide成为可能。研究者可以在短时间内测试多个靶点，筛选切割效率最高的guide，再批量进行编辑验证。对于需要构建多位点编辑或进行基因型-表型关联研究的实验室而言，这种效率提升是实质性的。
从数据上看，论文没有给出具体的编辑效率百分比或菌落数，而是以定性描述呈现预期结果。这与《STAR Protocols》作为方法学期刊的定位一致——重点是流程的可操作性和可重复性，而非特定实验的定量数据。对于读者而言，这套协议的价值在于降低了CRISPR酵母编辑的技术门槛，让更多实验室能够快速上手。
讨论与展望
这套PCR-based guide insertion策略的巧妙之处，在于把质粒环化的步骤交给大肠杆菌的体内同源重组机制完成。这不仅省去了体外连接步骤，还消除了对限制性内切酶位点的依赖。任何guide序列都可以通过设计引物直接安装，无需考虑酶切位点是否匹配。对于需要频繁更换靶点的研究场景，这种灵活性优势明显。
HDR供体设计中建议加入沉默PAM突变，这个细节值得关注。Cas9识别并切割靶位点后，如果修复后的序列仍保留完整的PAM序列，Cas9可能再次结合并切割，导致编辑失败或产生非预期突变。通过供体引入沉默突变破坏PAM，可以确保编辑后的序列不再被Cas9识别，从而提高编辑成功率。这一设计思路在多数CRISPR编辑协议中都有提及，但本协议将其列为标准步骤，体现了对编辑效率的重视。
质粒消除步骤的设计也颇为实用。KanMX标记在完成筛选后可以通过非选择性培养自然丢失，无需额外的反选择系统。这意味着最终获得的编辑菌株不携带任何外源标记，适合后续的代谢工程或表型分析。对于需要连续进行多轮编辑的研究，这种“用完即弃”的质粒设计减少了标记积累的问题。
这套协议仍有改进空间。论文未提供具体的编辑效率数据，也未比较不同guide之间的效率差异。对于切割效率较低的靶点，可能需要优化guide设计或HDR供体的长度。此外，LiAc/PEG转化的具体参数（细胞密度、DNA用量、热激条件等）未在摘要中详述，实际使用时可能需要根据实验室条件进行微调。
总体而言，这套协议提供了一种更简洁的酵母CRISPR编辑方案。它不追求单步骤的突破性创新，而是通过优化流程衔接，把多个环节的耗时和失败率同时降下来。对于日常需要处理大量编辑任务的实验室，这种系统性简化往往比单点优化更有价值。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protoc. PMID: 42519825.
PMID: 42519825