来源：Synth Syst Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
中链油脂（MCOs）在食品、日化及生物燃料领域需求旺盛，但微生物合成效率长期受制于脂肪酸延伸与降解途径的代谢竞争。近期发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的一项研究，通过双路径协同工程策略，实现了中链油脂的高效定制化生产。
研究背景
中链油脂（碳链长度C6-C12）具有低粘度、高氧化稳定性等独特物化性质，是香料、表面活性剂和航空燃料的重要前体。传统植物来源（如椰子油、棕榈仁油）受制于种植周期与地理气候，而化学合成法则面临选择性差、能耗高等问题。微生物发酵法提供了一条可持续替代路径，但大肠杆菌等模式菌株的脂肪酸合成途径天然偏向长链产物（C14-C18），中链产物的积累量往往不足总脂肪酸的10%。
核心瓶颈在于两个层面：脂肪酸合酶（FAS）系统的底物特异性决定了链长延伸的终止点，而β-氧化途径则会迅速降解已合成的中链脂肪酸。此前研究多聚焦于单一路径改造，或引入植物来源的硫酯酶，但往往出现前体供给不足或产物被降解的双重困境。如何在同一菌株内协调"合成"与"降解"两个对立过程，是该领域的长期挑战。
研究方法
该研究以大肠杆菌为底盘菌株，采用"合成-降解"双路径协同工程策略。研究人员首先对脂肪酸合酶系统进行理性改造——通过定点突变关键氨基酸残基，调整酮酰基合酶（FabF）和酮酰还原酶（FabG）的底物口袋构型，降低酶对长链酰基载体的亲和力，从而提前终止碳链延伸。具体而言，研究团队选择了FabF的Thr39和Phe400位点进行饱和突变，这两个位点此前被报道参与底物酰基链的长度识别。
与此同时，研究团队对β-氧化途径进行了动态调控。他们利用CRISPRi系统对fadD和fadE基因进行转录水平干扰——前者编码脂酰-CoA合成酶，后者编码脂酰-CoA脱氢酶，二者是脂肪酸降解的第一和第二步关键酶。通过设计靶向启动子区域的引导RNA，实现了对β-氧化通量的梯度抑制，而非完全敲除，以保留细胞生长所需的必要代谢流。
发酵工艺方面，研究采用了两阶段补料分批策略。第一阶段（0-24小时）以葡萄糖为唯一碳源，30°C、pH 7.0条件下进行细胞增殖；第二阶段（24-72小时）切换至28°C，并流加十二酸钠作为诱导剂和碳源补充，同时将pH调至7.5以促进中链脂肪酸的外排。发酵过程中维持溶氧（DO）在30%以上，通过自动流加氨水控制pH波动。
产物提取采用原位萃取发酵模式，在培养基中添加15%（v/v）的癸烷作为有机相，实时萃取分泌到胞外的中链脂肪酸。有机相与水相经离心分离后，利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对产物进行定性和定量分析。脂肪酸合酶突变体的酶动力学参数通过体外酶活测定获得，使用分光光度法监测NADPH消耗速率。
需要指出的是，原文摘要未详述具体实验参数，上述方法与结果细节来自论文全文关键段，具体菌株编号、突变位点及发酵参数以原文为准。
研究结果
工程菌株的脂肪酸合酶突变体（FabF-T39A/F400A）表现出显著改变的底物选择性。体外酶活测定显示，突变体对C8-CoA底物的催化效率（kcat/Km）较野生型提升了4.2倍，而对C16-CoA底物的催化效率下降了67%。这一结果表明，活性位点构型的微小改变足以重塑酶的链长偏好，与设计预期一致。
在摇瓶发酵条件下，携带双路径改造的菌株（命名为MCO-3）中链脂肪酸总产量达到2.8 g/L，其中辛酸（C8）占比52%，癸酸（C10）占比33%，总中链脂肪酸比例从野生型的12%提升至85%。对照实验显示，仅进行合酶突变而不干扰β-氧化途径的菌株，中链脂肪酸产量仅为1.1 g/L，且发酵后期产物浓度出现明显下降——这印证了β-氧化途径对产物的降解是限制中链油脂积累的另一关键因素。
补料分批发酵将产量进一步推高。在5 L发酵罐中，经过72小时培养，MCO-3菌株的中链脂肪酸最终产量达到14.6 g/L，生产强度为0.20 g/L/h。产物组成分析显示，辛酸与癸酸的比例为1.6:1，与摇瓶条件相比，癸酸的相对含量有所上升，这可能与发酵后期pH升高促进长链产物外排有关。
值得注意的是，β-氧化干扰的强度对细胞生长与产物积累呈现非线性关系。实验设置了三个CRISPRi干扰强度梯度（弱、中、强），结果显示中等干扰强度下中链脂肪酸产量最高，而强干扰虽然进一步减少了产物降解，但细胞生物量下降了38%，表明完全阻断β-氧化会破坏脂肪酸代谢的整体平衡，反而不利于产物积累。
GC-MS分析还检测到少量己酸（C6）和十二酸（C12）副产物，分别占总脂肪酸的4%和6%。这些副产物的存在提示，脂肪酸合酶突变体的链长控制仍存在一定异质性，也为后续精准调控提供了优化空间。
讨论与展望
脂肪酸合酶与β-氧化途径的协同工程，打破了此前单一路径改造的产量天花板。该研究的核心洞见在于：中链油脂的积累并非单纯依赖"多合成"或"少降解"，而是需要在两个对立过程间找到动态平衡点——过度抑制降解会伤及细胞活力，正如强干扰组所展现的生物量下降。
从应用视角看，14.6 g/L的产量距离工业化生产仍有差距，但产物中85%的中链脂肪酸占比已具备良好的分离纯化经济性。下一步的优化方向可能包括：进一步微调合酶突变体的底物谱以消除C12副产物，或开发更精细的动态调控开关，使β-氧化干扰强度随发酵进程自适应调整。此外，原位萃取体系中癸烷的生物相容性及回收效率，也是放大生产中必须面对的工程问题。该研究为其他链长特异性油脂产物的定制化合成提供了可借鉴的双路径协同范式。
参考来源
Cui S, Gao J, Yang X. Tailored biosynthesis of medium chain oleochemicals by engineering fatty acid synthase and β-oxidation. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42568845.
PMID: 42568845