酵母双通道光遗传学：多色光独立调控细胞过程与代谢通路

📅 2026-08-12 📰 Nat Commun 2026 May 22 📂 研究进展 👁 18

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

导读

光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但因所需基因数量多及不同波长光之间的交叉激活问题，多波长光遗传学一直未能在该物种中实现复用。本研究开发了一种仅需单基因、无需外源辅因子的紧凑型红光响应光遗传系统，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，最终与EL222蓝光系统整合，在酿酒酵母中建立了双通道光遗传平台，实现了黄酮类化合物木犀草素的合成调控和絮凝沉降辅助产物提取，还通过双色光遗传图案展示了活体材料开发潜力。

研究背景

光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比传统化学调控方法具有避免有害化学品、与生物系统正交、可通过光照引入和移除实现动态控制以及空间分辨等优势。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光等多种波长的光遗传系统相继开发，一个独特优势在于可将不同颜色光复用，实现对细胞中不同功能的独立正交控制。尽管多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑型正交光遗传系统及不同颜色光之间的交叉激活问题，酿酒酵母中仅实现了应用单一波长的单通道光遗传学。酿酒酵母是具有清晰遗传学和生物学背景的强大模式生物，已广泛用于生产有价值的化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品和临床治疗等多种合成生物学应用。

研究方法

将双通道光遗传学应用于生物材料图案化

本研究中双通道光遗传学的最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光图案指定特定位置细胞中基因激活的能力，对生物材料、神经科学和微生物群落相互作用研究具有重要价值。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投射到带有颜色或荧光基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"打印"到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传学实现了单色图像。

为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了菌株OY-γ.RB（红-蓝）。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。

▲ Cells were deposited on YNB agar by evaporating a layer of cells suspended in water overnight. Plates were exposed to 5% red light for 24 h through a mask, followed by 100% blue light for 24 hours through a mask. a Genetic circuit for OY- γ.RB (Red-Blue). b Imprinting letters spelling ‘I SEE YOU’. c

OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投射到表面（补充图16）。图案切割在黑纸上，作为滤光片，先用红光照射选定区域24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，无需近红外光来消除交叉激活（补充图17）。使用这种方法，研究团队成功印刻了从字母到标志和精细图像的多种多色图案，展示了该系统开发复杂活体材料的高空间分辨率和潜力。

光强度操作单位

光强度以百分比表示，对应Optobox中LED最大输出功率的比例。补充图19提供了各光强度的具体操作值（原文未详述具体辐照度数值）。

统计方法

数据以平均值±标准差表示，生物学重复数n=3或n=6。两组比较采用双尾独立t检验，显著性阈值标注为：NS = p > 0.1, = p < 0.1, = p < 0.05, = p < 0.01。

研究结果

在酿酒酵母中开发单组分红光通道

多种红光响应转录因子已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发。然而，它们的缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子，或需要额外基因在体内内源合成辅因子。考虑到双通道系统中包含太多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。尽管据其所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白（Idiomarina sp. A28L藻红素激活的鸟苷酸环化酶）获得。该蛋白由DNA结合结构域与来自IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合而成，PCM形成同源二聚体时阻止DNA结合结构域的二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变，允许DNA结合结构域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它利用内源产生的胆绿素IXa。因此推测它在酿酒酵母中同样功能正常——酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，该酶催化胆绿素的产生。

▲ a 双通道光遗传学能够对生物生产中所用生物体的代谢通量进行多功能控制，并可用于更复杂的工艺与优化。b 光遗传学在活体材料工程中具有潜在应用价值，利用两个光通道，可控制活体材料上多个基因的局部表达。c 我们的y-iLight红光通道机制示意图。d EL222蓝光通道机制示意图。

细菌中展示的iLight版本不能直接适配到酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活结构域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不理想，因为它利用酿酒酵母Gal4 DNA结合结构域，因此与酿酒酵母生物学不正交。为工程改造适合酿酒酵母的系统，研究团队将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合结构域替换为LexA蛋白。LexA常用于正交合成酿酒酵母转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA结构域，推测野生型LexA的蛋白构象同样功能正常。由于原始SV40 NLS在N端与Gal4结构域融合，SV40 NLS被重新附加到C端，产生了一个命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由CYC1核心启动子（cPCYC1）上游的8个串联lexO重复序列阵列组成。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，又克隆了两个额外质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆在低拷贝附加体质粒上的mCitrine荧光报告基因上游，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。

▲ a Genetic circuit of the iLight protein adapted to S.cerevisiae as a red light optogenetic system. b Expression of mCitrine fluorescent reporter through y-iLight paired with a lexO array upstream of various core promoters in comparison to constitutive P ACT1 . BY474R cells were cultured at 30 °C in

所有3个转化体在光遗传光盒（Optobox）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养。ACT1启动子（PACT1）在工业和研究应用中都是酿酒酵母常用且充分表征的启动子。为衡量工程启动子能否驱动足够水平的基因表达以用于实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，将y-iLight启动子替换为组成型PACT1并连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与保持在黑暗中的细胞相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度红光时表达均增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中无需任何额外辅因子即可工作。

不同的核心启动子导致不同的报告基因表达水平，研究注意到PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600未显示任何生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的特性。红光启动子非线性行为的一种可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合——因为转录激活因子在核心启动子附近结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是"促进扩散"，即由于转录因子在DNA链上拥挤，虽然初始结合速率增加，但转录因子的停留时间减少，导致启动子表达不良。两种提出的机制都会表现为高浓度活性转录因子存在下启动子表达降低。

三种启动子可能对光具有不同的敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及DNA区域（原文此句不完整，后续内容未在节选中提供）。

红光通道与蓝光通道的交叉激活降低

研究发现一个阻碍双通道光遗传学活性的意外问题是蓝光与红光通道之间存在交叉激活。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在其基态吸收可见光谱红光范围的光（原文此段不完整，后续内容未在节选中提供）。

▲ a Expression of mTurquoise by BY474B in response to red light compared to blue light and darkness. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator while exposed to 25% red light, 25% blue light or darkness. Fluorescence was measured at 24 h and normalized to OD 600 . Values are an average of 3 b

双通道光遗传系统的表征

▲ a Expression of mTurquoise and ( b ) expression of mCitrine in OY-α, OY-β.LINX, OY- β.mA1LINX and OY- β.mA6LEXY in increasing intensities of blue plus NIR(Near-Infrared) light. Strains were cultured at 30 °C in a shaking incubator and exposed to 50% NIR with 0-100% of blue light. Fluorescence was me

利用双通道光遗传控制黄酮类化合物合成

▲ a Enzymatic conversion of naringenin to luteolin through a diamond shaped pathway. b Genetic circuit for OY- γ.LutB/R(D). c Flavonoid production of OY- γ.LutB/R(D) in varying cycles of red and blue plus NIR(Near Infrard) light. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator in cycles with a per

动力学模型模拟

▲ a Simulated flavonoid concentrations when exposed to one cycle varying proportions of blue plus NIR(Near-Infrared) light followed by red light illumination ( n = 1). b A schematic diagram of the model elucidating the regulatory mechanisms and reaction kinetics of the two pathways for producing luteo

生长-生产-提取三阶段生物制造

▲ a Workflow of growth-production-extraction three-phase biomanufacturing. b Genetic circuit of OY- γ.LutFlo. c Photographs of flocculation of OY- γ.LutFlo in various light conditions. Cultures were kept in either darkness for 48 h, 50% NIR(Near-Infrared) light for 48 h, or 24 h of 25% blue plus 50% N

讨论与解读

本研究成功开发了酿酒酵母的单组分红光光遗传系统y-iLight，仅需一个转录因子且不依赖外源添加辅因子。与最近开发的PhiReX系统（需要表达四个不同基因，包括酿酒酵母非内源辅因子的生物合成基因）相比，y-iLight更为紧凑。PhiReX 1.1实现了高达41倍诱导，水平接近天然启动子PADH1；PhiReX 1.0达到约PADH1强度的2倍，但仅11倍诱导。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然启动子PACT1相当，动态范围介于PhiReX 1.0和1.1之间。研究还发现蓝光与红光通道之间存在交叉激活，通过模块化蛋白结构域工程（包括光诱导核输出序列和光敏降解子）有效降低了这种串扰。

编译者解读

该研究的核心价值在于将光遗传学从单波长推进到双波长正交控制，且红光组件仅需单基因、无外源辅因子，大幅降低了系统复杂性和代谢负担。从合成生物学应用角度看，双色光独立控制代谢通路为动态调控提供了新的时间-空间维度——例如本研究展示的木犀草素合成与絮凝沉降耦合，直接服务于"生长-生产-提取"一体化生物制造流程。双色图案化活体材料的演示则指向了光遗传学生物制造之外的潜在应用场景。值得关注的是，该系统在蓝光交叉激活的工程化改造中采用了模块化蛋白结构域策略，这种"可替换模块"设计思路对未来多波长扩展具有方法论意义。局限在于当前仍以荧光报告和模式代谢物验证为主，向工业规模放大时需考虑光穿透深度和培养体系光学性质等工程问题。

参考来源

Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nat Commun. PMID: 42173879.

PMID: 42173879

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