来源：Front Bioeng Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
异黄酮类植物次生代谢产物在营养保健和制药领域潜力巨大，但传统作物提取路线既不经济也不可持续。近日，一支研究团队在工程酵母中构建了完整的毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（CG）从头生物合成途径，摇瓶发酵产量达到47.60 mg/L，并通过理性蛋白工程改变了植物糖基转移酶的底物偏好。该成果发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》。
研究背景
黄芪是传统中医药中的重要药材，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（CG）是其关键质量标志物之一。这种异黄酮苷类化合物属于植物次生代谢产物家族，具有显著的健康促进作用，在功能食品和制药行业备受关注。然而，从黄芪等药用植物中提取CG面临两大难题：一是活性成分含量低，提取成本高昂；二是依赖大规模种植，资源可持续性差。
合成生物学的兴起为这类天然产物的获取提供了新路径。通过将植物来源的完整生物合成途径导入微生物宿主，利用工程酵母或大肠杆菌以简单碳源为原料发酵生产目标化合物，已成为替代传统植物提取的热门策略。异黄酮在植物体内的合成通常涉及多个酶促步骤，包括O-甲基转移酶（OMT）、细胞色素P450单加氧酶和UDP-糖基转移酶（UGT）的协同作用。将这套多步催化体系完整移植到微生物中，并协调各步酶的表达效率和辅因子供应，是构建细胞工厂的核心挑战。
此前研究多聚焦于异黄酮母核或简单衍生物的微生物合成，对CG这类结构较复杂、涉及三步连续修饰的异黄酮苷类化合物的完整从头合成报道较少。本研究旨在筛选高活性的植物催化酶、优化碳源和辅因子供给，最终在酵母中打通从简单碳源到CG的全合成路线。
研究方法
菌株与载体构建
研究以酿酒酵母IMX581为背景菌株，采用高拷贝载体p426GPD进行基因表达。该载体携带强组成型启动子TDH3p，可确保外源基因在酵母中稳定高效转录。
CG的生物合成在植物中由三步酶促反应完成。第一步，异黄酮骨架染料木素（DEIN）经O-甲基转移酶（OMT）催化，在4′-OH位发生特异性甲基化生成芒柄花素（FON）；第二步，细胞色素P450异黄酮3′-羟化酶（I3′H）催化FON在3′-OH位羟基化，生成毛蕊异黄酮（CLN）；第三步，UDP-糖基转移酶（UGT）在7-OH位连接葡萄糖基，最终生成CG。
为筛选各步反应的活性酶，研究者从多种植物中克隆了候选基因。针对OMT反应，选取了4个候选基因：来自野葛的PlOMT9、来自黄芪的AmOMT、来自紫花苜蓿的MsOMT8和来自大豆的GmOMT2。这些基因分别克隆入p426GPD载体，构建重组质粒pCG01-04，并转化至IMX581菌株，获得重组菌株ES02等。
体内活性筛选
采用体内活性测定法快速鉴定植物候选基因的功能。将携带不同OMT基因的重组酵母菌株在摇瓶中培养，向培养基中添加50 mg/L的DEIN作为底物，检测FON的生成情况。结果显示，仅携带PlOMT9基因的菌株ES02能够将DEIN转化为FON，产量为5.00 mg/L。
针对I3′H反应，测试了3个候选基因，其中来自黄芪的AmI3′H和来自蒺藜苜蓿的MtI3′H对FON表现出可检测的催化活性。原文摘要未详述I3′H筛选的具体底物浓度和转化率参数。
碳源优化与前体供给
在确定三步反应的活性酶后，研究者对发酵条件进行了系统优化。碳源选择是影响酵母生长和异源蛋白表达的关键因素。原文摘要未详述碳源优化的具体种类和配比，但指出通过优化碳源、利用和供给关键前体DEIN、以及工程化关键代谢辅因子的生物合成，最终实现了CG的高效生产。
辅因子工程
异黄酮生物合成途径中的P450酶依赖NADPH作为电子供体，UGT反应则需要UDP-葡萄糖作为糖基供体。研究者对酵母内源辅因子代谢途径进行了工程改造，以增强NADPH和UDP-葡萄糖的供给。原文摘要未详述辅因子工程的具体基因操作靶点和表达策略。
蛋白工程改造
除筛选天然酶外，研究还尝试通过理性蛋白工程改变所选植物糖基转移酶的底物偏好。原文摘要未详述突变位点设计和筛选方法的具体细节，但证实了通过蛋白工程手段能够有效调整UGT对底物的选择性。
研究结果
从头合成途径的建立
通过在酵母中逐步引入筛选得到的活性植物酶，研究者成功构建了CG的完整从头生物合成途径。在摇瓶发酵条件下，以简单碳源为原料，无需外源添加中间底物，最终CG产量达到47.60 mg/L。这一结果验证了将植物三步酶促反应完整移植到酵母中的可行性。
OMT酶的筛选结果
在4个候选OMT基因中，仅野葛来源的PlOMT9在酵母中表现出对DEIN的甲基化活性。在含50 mg/L DEIN的培养基中，携带PlOMT9的菌株ES02摇瓶培养后产生5.00 mg/L的FON。其余3个OMT基因（AmOMT、MsOMT8、GmOMT2）均未检测到FON生成，表明不同植物来源的OMT在酵母异源表达体系中的活性差异显著。
I3′H酶的筛选结果
在3个候选I3′H基因中，黄芪来源的AmI3′H和蒺藜苜蓿来源的MtI3′H对FON表现出可检测的催化活性。原文摘要未提供I3′H催化反应的具体转化率和产物浓度数据。
蛋白工程的可行性验证
通过理性蛋白工程改造，研究者成功改变了所选植物糖基转移酶的底物偏好。这一结果证明，针对植物UGT的底物选择性进行定向改造是可行的，为后续优化CG合成途径中最后一步糖基化反应提供了新工具。原文摘要未详述改造后UGT的底物谱变化和动力学参数。
发酵性能总览
在摇瓶发酵条件下，工程酵母菌株能够以简单碳源为原料从头合成CG，最终产量为47.60 mg/L。整个合成途径涉及3步酶促反应，包括OMT催化的甲基化、P450 I3′H催化的羟基化和UGT催化的糖基化。研究同时整合了碳源优化、前体供给和辅因子工程等多项策略，共同支撑了CG的高效合成。
讨论与展望
本研究构建的酵母平台实现了CG从简单碳源到终产物的完整从头合成，47.60 mg/L的摇瓶产量在异黄酮苷类化合物的微生物合成研究中处于有竞争力的水平。值得注意的是，研究团队通过理性蛋白工程改造植物糖基转移酶的底物偏好，这一策略拓展了合成生物学的工具箱——不再局限于筛选天然酶，还能按需重塑酶的选择性。
该研究选择的碳源优化、前体DEIN的利用和供给、以及代谢辅因子工程三大策略，分别从途径通量、前体供应和能量/糖基供体三个层面保障了CG合成的高效运行。这种多维度协同优化的思路，对其它异黄酮类化合物的微生物合成具有参考价值。
当然，从摇瓶到工业规模生产仍有距离。CG产量还需进一步提升，发酵工艺的放大效应、产物提取纯化等下游环节也待完善。原文摘要未提供发酵罐放大实验和纯化工艺的数据。该平台有望扩展应用于其它高价值异黄酮类化合物的微生物从头合成，为植物天然产物的可持续供应提供新选择。
参考来源
Zhang W, Xu M, Wang L, Qiao X, Yang S. Efficient, complete biosynthesis of isoflavonoid calycosin-7-glucoside by metabolically engineered yeast cell factories. Front Bioeng Biotechnol. PMID: 42495113.
PMID: 42495113