来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
导读
纳米银颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性在活性包装和伤口敷料领域备受关注。本研究从土耳其萨姆松省家庭酿醋中分离出5株醋杆菌属（Acetobacter sp.）和1株Komagataeibacter sp.，利用其细菌纤维素生产过程中产生的液体废液作为反应介质，绿色合成银纳米颗粒。研究系统表征了AgNPs的物理化学性质，评估了其抗菌、抗氧化、细胞毒性及食品包装应用潜力。SPR峰出现在414–432 nm，颗粒尺寸20–100 nm，其中KX1-AgNPs的DPPH清除率达56.01%。
研究背景
纳米技术已在医学、环境和农业领域引发革命性发展，纳米材料至少有一个维度介于1–100 nm之间。凭借小尺寸带来的高比表面积和特殊的生物系统相互作用，纳米材料展现出独特的功能优势。银纳米颗粒是纳米技术中广泛应用的金属纳米颗粒，具有抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化等特性，可用于伤口愈合材料、生物传感器、药物递送系统和食品包装等领域。
传统物理和化学法制备金属纳米颗粒往往涉及有毒化学品、能耗高且产生环境有害废物。以“绿色合成”著称的生物方法因利用环境友好试剂和减少有毒废物排放而日益受到重视。微生物因其能够将环境中的金属离子进行生物还原，被视为纳米颗粒合成的有效生物催化剂。此外，该过程中产生的生物分子可作为纳米颗粒的天然稳定剂，减少颗粒聚集并提高稳定性。细菌纳米颗粒的生物合成可通过胞内和胞外两种途径进行。
研究方法
菌株供应与保存
用于AgNPs生产的醋酸菌分离自家酿醋，被鉴定为纤维素酶产生菌。菌株取自奥ndokuz Mayıs大学Karadeniz先进技术研究与应用中心的−80 °C冷冻库。菌株在Hestrin-Schramm（HS）琼脂培养基（5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、1.15 g/L柠檬酸、2.7 g/L Na₂PO₄、15 g/L琼脂）上培养以确认纯度。整个研究期间菌株保存于4 °C。
AgNP生产的筛选
分离株在HS肉汤中于30 °C培养21天以进行细菌纤维素生产。培养后，小心去除培养液表面形成的纤维素膜。剩余培养液以10,000 × g离心10分钟，随后过滤获得无细胞上清液。该上清液代表细菌纤维素生产过程中产生的液体废物，用作银纳米颗粒合成的反应介质。AgNP生产时，将培养上清液与AgNO₃溶液混合，使最终AgNO₃浓度为3 mM。反应混合物在50 °C黑暗中孵育48小时。通过UV–Vis分光光度法监测表面等离子体共振（SPR）确认银纳米颗粒的形成。
基于16S rRNA基因的分离株鉴定
提取DNA用于醋酸菌鉴定，使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒。16S核糖体DNA片段通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，引物为27正向（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492反向（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'），按试剂盒流程操作。反应使用Thermo Scientific DreamTaq DNA聚合酶。PCR混合物包含：4 µL基因组DNA、5 µL 10 ×缓冲液混合物、1 µL脱氧核苷三磷酸、各3 µL引物混合物、0.25 µL DreamTaq（Thermo Scientific）和33.75 µL无核酸酶水。反应程序为：95 °C初始变性3分钟，然后40个循环（95 °C 30秒、55 °C 30秒、72 °C 1分钟），最后72 °C延伸15分钟。使用Genepro热循环仪（中国，Bioer Technology）TC-E-96G型号运行。
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶（含10 µL/mL EtBr）电泳评估大小和完整性，90 V运行90分钟，DNA条带通过Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）可视化。PCR产物经分光光度法测定密度和纯度（A260/A280），用SeqLine CleanSEQ试剂盒纯化，然后通过ABI 3130遗传分析仪（Applied Biosystems）双向测序。使用Chromas程序（Technelysium Pty. Ltd.）检查正反向引物获得的DNA序列质量，并用BioEdit程序组装。序列与EzBioCloud 16S数据库（https://www.ezbiocloud.net/）中的16S rRNA基因序列进行比对。最后使用MEGA 6程序通过邻接法构建系统发育树。
AgNPs的生产与回收
首先，将AgNO₃加入从21天细菌培养物（HS肉汤，30 °C，150 rpm振荡条件）中离心（10,000 × g，10分钟）分离的上清液中，使终浓度为3 mM。反应混合物在50 °C黑暗中孵育48小时，然后离心（13,000–15,000 × g，30分钟）沉淀合成的AgNPs。随后用超纯水洗涤AgNPs，在50 °C无湿干燥箱中干燥，最后避光保存备用。
AgNPs的理化表征
扫描电子显微镜（SEM）与EDS mapping成像：微观结构表征
将适量AgNP粉末置于0.5 cm²玻璃载玻片上，使用JEOL JSM-7001F场发射扫描电子显微镜（FESEM）在15 kV下分析样品。使用FESEM内置的X-Max 80 mm²检测器（Oxford Instruments，英国）在同一载玻片上进行EDS mapping。
衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
干燥AgNPs的ATR-FTIR分析使用PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR光谱仪（德国）在400–4000 cm⁻¹范围内进行，分辨率4 cm⁻¹。分析前，合成的AgNPs经离心并用蒸馏水多次洗涤以去除未结合的生物分子和残余杂质，然后在室温下干燥。少量干燥纳米颗粒粉末直接置于ATR晶体表面，无需进一步制备。通过多次扫描平均记录光谱以提高信噪比。获得的光谱用于鉴定与AgNPs还原和稳定相关的生物分子官能团。特别分析了O–H、C=O、C–O和N–H对应的特征吸收带，以评估蛋白质、多糖或其他有机化合物在纳米颗粒合成和包封中的参与。
X射线衍射（XRD）分析
合成的AgNPs晶体结构通过XRD分析确定，使用Rigaku SmartLab衍射仪（Rigaku SmartLab Beijing Co.，中国），配备Cu Kα辐射（λ = 1.5406 Å）和Cu Kβ滤光片。AgNP粉末样品在分析前经干燥和细磨以确保均匀性。衍射图谱在2θ范围10–80°内记录，扫描速率2°/min，操作条件40 kV和30 mA，连续扫描模式。获得的衍射峰与标准粉末衍射联合委员会（JCPDS）数据比对，确认银的面心立方（FCC）晶体结构。（111）、（200）、（220）和（311）平面对应的特征衍射峰用于验证晶体AgNPs的形成。此外，基于最强衍射峰的半高宽（FWHM），使用Debye–Scherrer方程估算平均晶粒尺寸。
动态光散射（DLS）与Zeta电位（ζ）
AgNPs在超纯水（折射率：1.330，粘度：0.8872）中的尺寸分布、平均直径和Zeta电位使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical，英国）在25 °C下分析。2 mL AgNPs悬浮液（1 mg/mL）置于石英比色皿中，经激光照射，通过布朗运动分析散射光波动以确定颗粒尺寸。
抗菌活性分析
测试的多种微生物包括蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），这些微生物通常与食品污染、腐败或食源性感染相关。因此，选择这些微生物评估合成的AgNPs在食品保鲜和活性包装系统中的潜在应用。革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 43300——耐甲氧西林）、金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 25923——甲氧西林敏感）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus NTCC 7464）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis ATCC 6633）和粪肠球菌（E. faecalis ATCC 29212）。
研究结果
菌株供应、AgNP生产与表征
从萨姆松省生产的家庭酿醋中分离的、能够合成纤维素的醋酸菌中，鉴定出适合银纳米颗粒（AgNP）生产的菌株。反应混合物从浅黄色变为红棕色的视觉变化是判断适宜性的基础，UV–Vis光谱分析验证了这一变化。此外，光谱中出现代表表面等离子体共振（SPR）振动的特征峰以及350–450 nm范围内的吸收峰，证实了AgNPs的合成。如图1所示，可从苹果醋（1A、1B、3A）、无花果醋（2B、2D）和梨醋（X1）中分离的细菌培养上清液合成AgNPs。
银纳米颗粒的理化特性可从SPR峰推断。SPR峰随AgNP尺寸减小而向更短波长移动。此外，SPR峰强度随悬浮液中纳米颗粒浓度增加而增强。SPR光谱中观察到的吸收带宽度指示颗粒尺寸分布：宽带反映多尺寸分布，而窄带指示均匀分布，即单尺寸分布。据此，从分离株1A、1B、3A和2B培养上清液合成的AgNPs直径更小，分布比从分离株2D和X1合成的更均匀。这表明这些分离株的代谢物谱在形成过程中更有效地控制了AgNPs的尺寸。所有合成的AgNPs浓度处于相似水平。这一发现揭示，尽管颗粒尺寸和分布存在差异，各分离株的总纳米颗粒合成产量基本保持。此外，培养上清液在纳米颗粒特征区域未显示明显吸收峰，AgNO₃溶液同样未显示SPR相关吸收。
从分离株获得的16S rRNA基因序列使用EzBioCloud平台分析与数据库记录比对。序列经比对后，使用邻接法构建系统发育树（图2）。分离株1A、1B、3A、2B和2D属于同一单系群，具有高bootstrap值（93–97%）。这些分离株与Acetobacter pasteurianus、Acetobacter oryzoeni、Acetobacter ascendens和Acetobacter oryzifermentans等物种密切相关。根据核苷酸相似性，确定它们在系统发育上与A. pasteurianus更接近。另一方面，分离株X1与Komagataeibacter属物种聚为一支，与Komagataeibacter medellinensis和Komagataeibacter intermedius密切相关。菌株编号、属和GenBank登录号见表1（源自美国国家生物技术信息中心NCBI）。登录号（PV341489–PV341662）确认序列已存入NCBI数据库。
系统发育树显示，分离株1A、1B、3A、2B和2D位于醋杆菌科醋杆菌属的单系群内，而分离株X1位于Komagataeibacter单系群内。分离株1A、1B、3A、2B和2D形成由高bootstrap值（93–97%）支持的分支。这一聚类表明这些分离株可能属于同一分类群。然而，由于醋酸菌表型相似，物种水平的区分通常较为困难。结果表明，需要包含基因型特征的化学分类学表征才能实现物种水平区分的分类学确定性。
表1 菌株编号、来源、菌种及NCBI登录号
| 菌株编号 | 分离来源 | 菌种 | 登录号 |
|---------|---------|------|--------|
| 1A | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341489 |
| 1B | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341624 |
| 2B | 无花果醋 | Acetobacter sp. | PV341496 |
| 2D | 无花果醋 | Acetobacter sp. | PV341505 |
| 3A | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341506 |
| X1 | 梨醋 | Komagataeibacter sp. | PV341662 |
AgNPs的理化表征
AgNPs的显微表征（电子显微镜）结果
图3显示了从六株不同醋源分离的细菌培养上清液合成的AgNPs的SEM图像。SEM研究揭示了合成纳米颗粒在尺寸和分布上的菌株特异性差异，确认所有分离株的培养上清液均可生产AgNPs。从Acetobacter sp. 1B、2D和3A培养上清液合成的AgNPs（A1B-AgNPs、A2D-AgNPs和A3A-AgNPs）直径分别为20–40 nm、30–60 nm和30–70 nm，且分布比其他合成纳米颗粒更均匀。从Acetobacter sp. 1A和Komagataeibacter sp. X1培养上清液合成的AgNPs（A1A-AgNPs和KX1-AgNPs）呈球形，尺寸范围30–100 nm，但形态相对不规则。另一方面，用Acetobacter sp. 2B培养上清液合成的AgNPs（A2B-AgNPs）呈棒状并发生团聚。
表2中的EDS图谱显示AgNP结构具有相同组分。Ag占46–93%——这是预期的，因为银是银纳米颗粒的主要成分。碳、氮和氧各占质量比最高20%。表面的有机化合物可能表明存在还原/包被剂。P、S和Cl（<4%）来自生物分子或合成环境。Na和Al以痕量存在，被认为是污染物或缓冲盐。Ahmed等人（2016）报道，在植物基合成中，EDS检测到Ag旁边有高比例的C、N和O。Bar等人报道，银纳米颗粒周围的酚类包被在EDS中表现为C和O。根据Durán等人的研究，蛋白质包被的银纳米颗粒的元素分析揭示了AgNP周围蛋白质层的特征性氮和磷信号。AgNP表面的SEM图像显示，最致密和最亮的纳米颗粒分布…
讨论与解读
本研究利用醋菌生产细菌纤维素过程中产生的液体废液，建立了一种新颖且可持续的AgNPs绿色合成方法。合成的AgNPs通过XRD、SEM和FTIR分析成功表征，确认了球形形态和晶体结构。生物学评价揭示，部分纳米颗粒变体，特别是KX1-AgNPs和A2B-AgNPs，表现出抗氧化和抗菌活性，并对细胞活力呈现浓度依赖性细胞毒性效应。此外，随着基于AgNP的活性包装系统日益普及，必须仔细考虑银离子或纳米颗粒向食品基质中潜在迁移的问题。确实，一些研究表明这种迁移可能引起毒理学效应。因此，未来的研究应包括全面的安全性评估，以确保含AgNP的材料能够在食品接触应用中安全、负责任地使用。
除结构表征结果外，DLS和Zeta电位分析进一步支持了生物合成纳米颗粒的功能稳定性和适用性。DLS测量获得的流体动力学直径（85–179 nm）以及PDI值（0.274–0.402）表明，取决于细菌分离株，纳米颗粒群体呈现中等单分散至异质分布。
编译者解读
本研究将醋菌纤维素发酵废液“变废为宝”，以废液中的天然生物分子同时充当还原剂和稳定剂，省去了传统化学合成中的有毒试剂和复杂后处理步骤。6株菌株产出的AgNPs在尺寸、形貌和表面电荷上呈现菌株依赖性差异，提示可通过筛选特定菌株来定制纳米颗粒性能。KX1-AgNPs在抗氧化和抗菌方面的突出表现，加上X1膜在食品保鲜中的效果，使该体系在活性包装领域具有实际转化潜力。不过，银离子向食品迁移的安全性评估仍是商业化前必须跨越的门槛。
参考来源
Akbaş P, Adıgüzel AO, Kaya E, Adıgüzel SK, Uğurtay E. Sustainable biosynthesis of silver nanoparticles from vinegar bacteria fermentation waste: characterization, bioactivity and food packaging potential. Sci Rep. PMID: 42129258.
PMID: 42129258