来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
光遗传学利用光在基因水平调控细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现出应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但因所需基因数量多及不同波长光之间的交叉激活问题，多种波长的光遗传学一直未能在酿酒酵母中实现多路复用。本研究开发了一种仅需单基因、无需外源辅因子的红光响应光遗传系统，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，与EL222蓝光光遗传系统整合，在酿酒酵母中建立了双通道光遗传平台，实现了黄酮类化合物木犀草素合成的光控以及细胞絮凝的诱导，并展示了双色光遗传图案化活体材料的潜力。
研究背景
光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比传统化学调控方法，具有避免有害化学品、与生物系统正交、可动态调控以及具备空间分辨率等优势。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光等不同波长光遗传系统的发展，多路复用不同颜色光以实现细胞内独立、正交的调控成为独特优势。
尽管多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中得到验证，但由于缺乏紧凑的正交光遗传系统以及不同颜色间的交叉激活问题，酿酒酵母中仅实现了单通道光遗传学应用。酿酒酵母是强大的模式生物，遗传学和生物学背景清晰，已广泛应用于生产高价值化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品及临床治疗等多个合成生物学领域。本研究旨在填补酿酒酵母多路光遗传学的空白。
研究方法
双通道光遗传学在生物材料图案化中的应用
本研究中双通道光遗传学的最终应用是发挥光遗传学的空间分辨率优势。利用光图案在特定位置激活细胞中基因表达的能力，已广泛应用于生物材料、神经科学及微生物群落相互作用研究。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投影到带有颜色或荧光基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"印刷"到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传学实现过单色图像。
为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了OY-γ.RB（红-蓝）菌株。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。
细胞通过将悬浮于水中的细胞层过夜蒸发沉积在YNB琼脂上。平板通过掩膜暴露于5%红光24小时，随后通过掩膜暴露于100%蓝光24小时。OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投影到表面（补充图16）。图案被切割成黑色纸张作为滤光片，选择性地用红光照射24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，无需近红外光即可消除交叉激活（补充图17）。利用该方法，研究团队成功印刷了从字母到标志及精细图像的多种多色图案，展示了系统的高空间分辨率及开发复杂活体材料的潜力。
研究结果
在酿酒酵母中开发单组分红光通道
多种红光响应转录因子已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发。然而，这些系统存在需要整合多个基因、添加外源辅因子或需要额外基因进行体内辅因子内源合成等缺点。考虑到双通道系统中过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。虽然据其所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白衍生而来。该蛋白由DNA结合域与来自IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合而成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域的二聚化。在红光（660 nm）照射下，PCM构象改变使DNA结合域二聚化，从而结合认知DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因其利用内源产生的胆绿素IXa。研究团队推断其在酿酒酵母中同样适用，因为酿酒酵母表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。
细菌中展示的iLight版本不能直接适配到酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不宜使用，因其利用酿酒酵母Gal4 DNA结合域，无法与酿酒酵母生物学正交。为工程改造适合酿酒酵母的系统，研究团队将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白。LexA常用于酿酒酵母正交合成转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA域，研究团队推断野生型LexA的蛋白构象应具有类似功能。由于原始SV40 NLS在N端与Gal4域融合，SV40 NLS被重新附加到C端，产生命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。Y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。认知启动子改编自Stelling等人，由CYC1核心启动子（cPCYC1）上游的8个串联lexO重复序列阵列组成。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，克隆了两个额外质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆在低拷贝附加体质粒上的mCitrine荧光报告基因上游，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。
所有3个转化体在光遗传学光箱（Optobox，设备规格见补充注释15）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%的红光强度培养。ACT1启动子（PACT1）是酿酒酵母中充分表征的启动子，广泛用于工业和研究应用。为评估工程启动子是否能驱动足够水平的基因表达以满足实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，用组成型PACT1替换y-iLight启动子并连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与黑暗条件下培养的细胞相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各强度红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中无需任何额外辅因子即可工作。
不同的核心启动子导致不同水平的报告基因表达，值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600未显示任何生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的伪影。红光启动子非线性行为的一种可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为转录激活因子在核心启动子附近的结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能机制是"促进扩散"，即由于转录因子在DNA链上拥挤，虽然初始结合速率增加，但转录因子停留时间减少，导致启动子表达不佳。两种提出的机制都会表现为高浓度活性转录因子存在下启动子表达降低。
三种启动子对光的敏感性可能不同，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及DNA中聚合酶最初结合并开始转录的区域。
讨论与解读
酿酒酵母单组分红光光遗传系统的开发
本研究为酿酒酵母重构了一个响应红光刺激的光遗传系统，仅需单一转录因子且不依赖任何外源添加的辅因子。这填补了酿酒酵母缺乏紧凑型单组分红光光遗传系统的空白，使光遗传学在酿酒酵母中的多路复用应用成为可能。相比之下，最近开发的酿酒酵母红光响应转录因子PhiReX需要表达四个不同基因，包括用于合成酿酒酵母非内源辅因子的基因。PhiReX 1.1可实现高达41倍诱导，水平与酿酒酵母天然启动子PADH1相当；PhiReX 1.0可实现约PADH1强度的2倍，但仅11倍诱导。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然启动子PACT1相当。因此，y-iLight系统的动态范围介于PhiRex 1.0和1.1之间，同时与常用天然启动子水平相当。
一个阻碍双通道光遗传活性的意外交互是蓝光与红光通道之间的交叉激活。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在基态吸收可见光谱红光范围的光。
编译者解读
本研究的关键突破在于以最小基因负担实现红光响应——单基因、无外源辅因子，这为多路光控提供了宝贵的"正交模块"。将红光通道与EL222蓝光通道整合，并利用模块化蛋白工程（核输出序列与光敏降解子）降低交叉激活，展示了系统性的工程设计思维。在木犀草素合成与絮凝提取中的验证，使该技术直接对接了合成生物学的实际生产需求。局限在于y-iLight的非线性光响应特性及蓝光交叉激活仍需进一步优化。从应用角度看，双色图案化活体材料的演示为光遗传学在生物制造和智能材料领域的拓展提供了新方向。
PMID: 42173879