来源：Front Bioeng Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导语
异黄酮类植物次生代谢产物在营养保健与制药领域价值显著，但传统植物提取路线受制于成本与可持续性。2025年发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的一项研究，通过在酿酒酵母中重构三步酶促反应途径，实现了重要药用黄芪质量标志物毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷（CG）的从头合成，摇瓶产量达47.60 mg/L。该工作还展示了理性蛋白工程改造植物糖基转移酶底物偏好性的可行性，为工业化生物制造CG及其他高价值异黄酮奠定了基础。
研究背景
异黄酮是豆科植物中一类特征性的次生代谢产物，因其显著的人类健康促进作用，在功能性食品和制药工业中备受关注。传统生产方式依赖作物种植提取，不仅周期长、得率低，而且受土地资源和气候条件制约，难以满足日益增长的市场需求。构建微生物细胞工厂，利用可再生碳源从头合成这些生物活性分子，被视为一种更具经济性和可持续性的替代方案。
毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷（CG）是药用黄芪的重要质量标志物。在植物体内，CG的生物合成以异黄酮骨架染料木素（daidzein, DEIN）为底物，经由三步酶促修饰完成：首先由O-甲基转移酶（OMT）催化4′-羟基特异性甲基化生成芒柄花素（formononetin, FON）；随后细胞色素P450异黄酮3′-羟化酶（I3′H）在3′-位引入羟基，将FON转化为毛蕊异黄酮（calycosin, CLN）；最后UDP-糖基转移酶（UGT）在7-位连接葡萄糖基，生成终产物CG。要在微生物宿主中重建这条途径，关键在于筛选到具有催化活性的植物来源酶元件，并协调宿主代谢网络为各步反应提供充足的前体和辅因子。
研究方法
该研究采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）IMX581作为底盘菌株，通过逐步整合异源酶基因、优化碳源、外源补充前体以及工程改造辅因子代谢等策略，构建CG的从头生物合成途径。
植物酶元件的筛选与表达质粒构建。 研究首先针对三步反应分别筛选候选植物基因。对于OMT催化步骤，选取了四个编码基因：来自野葛（Pueraria lobata）的PlOMT9、来自黄芪（Astragalus membranaceus）的AmOMT、来自紫花苜蓿（Medicago sativa）的MsOMT8以及来自大豆（Glycine max）的GmOMT2。这些基因被克隆至高拷贝载体p426GPD，受强组成型启动子TDH3p驱动，构建质粒pCG01-04。随后将各质粒分别转化至背景菌株IMX581，挑取单菌落用于后续分析。
体内活性测定与菌株筛选。 为快速鉴定具有功能的植物酶元件，研究采用饲喂相应底物的体内活性测定法。在含50 mg/L DEIN的培养基中进行摇瓶培养时，仅携带PlOMT9基因的菌株ES02能够产生中等量的FON，产量为5.00 mg/L。对于I3′H催化步骤，测试了三个候选基因，其中来自黄芪的AmI3′H和来自蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的MtI3′H对底物FON表现出可检测的催化活性，而第三个候选基因未显示明显活性（原文摘要未详述该基因名称及具体活性数据）。
完整途径的组装与发酵优化。 在确定各步活性酶元件后，研究将完整的CG生物合成途径组装至酵母菌株中。发酵过程中，研究系统考察了碳源种类对产量的影响，通过优化碳源组成提升前体供给。同时，鉴于DEIN是CG生物合成的关键前体，研究中采用外源添加DEIN的策略确保底物供应。此外，研究还对关键代谢辅因子（如UDP-葡萄糖）的生物合成途径进行了工程改造，以增强糖基化步骤的辅底物供给。原文摘要未详述碳源优化的具体种类与浓度、辅因子工程的具体靶点及改造方式、发酵温度与转速等参数。
糖基转移酶的理性蛋白工程。 在实现完整生物合成的基础上，研究进一步探索了通过理性蛋白工程手段改变所选植物糖基转移酶底物偏好性的可行性。原文摘要未提供该蛋白工程改造的具体突变位点、设计策略及改造后酶的动力学参数。
研究结果
异源酶元件的功能鉴定。 通过体内活性筛选，研究从四个OMT候选基因中鉴定出PlOMT9为功能性酶，能够在酵母中催化DEIN的4′-O-甲基化生成FON。在含50 mg/L DEIN的条件下，表达PlOMT9的菌株ES02摇瓶培养后FON产量为5.00 mg/L。值得注意的是，来自黄芪自身的AmOMT在该筛选体系中未表现出可检测的FON生成活性，这一结果凸显了异源表达中酶来源选择的重要性。对于I3′H步骤，AmI3′H和MtI3′H两个基因均表现出将FON转化为CLN的催化功能，为后续组装完整途径提供了备选元件。
CG的从头生物合成与产量提升。 将筛选得到的活性酶元件与糖基转移酶基因共同组装至酵母菌株后，研究实现了CG的从头生物合成。通过优化碳源、外源供给关键前体DEIN以及工程改造代谢辅因子生物合成，最终在摇瓶发酵条件下从简单碳源实现了47.60 mg/L的CG产量。原文摘要未提供各优化步骤对产量贡献的逐级数据，也未详述最终菌株的遗传特征（如基因拷贝数、整合位点等）。
糖基转移酶底物偏好性的理性改造。 研究证实了通过理性蛋白工程改变植物糖基转移酶底物选择性的可行性。原文摘要未提供改造前后酶对底物亲和力、催化效率（kcat/Km）等具体动力学参数，也未说明改造对CG最终产量的影响幅度。
讨论与展望
该研究在酿酒酵母中完整重构了CG的三步生物合成途径，实现了从简单碳源到目标产物的从头生产，摇瓶产量达到47.60 mg/L。这一成果的意义不仅在于CG本身的成功合成——更重要的是，它建立了一个可复用的技术框架：从植物酶元件的体内功能筛选，到碳源与前体供给的协同优化，再到辅因子代谢的针对性工程，这一整套策略可直接迁移至其他异黄酮类化合物的微生物合成。
研究中一个值得深思的细节是，来自黄芪自身的AmOMT在酵母中未能催化DEIN甲基化，而来自野葛的PlOMT9却表现出活性。这提示植物来源酶在异源宿主中的功能表现与预期并不总是一致，体内筛选策略在途径构建初期具有不可替代的价值。此外，对糖基转移酶底物偏好性的理性改造，为拓展产物谱系提供了新的操作维度——若能将糖基转移酶改造为接受不同异黄酮苷元，则可实现多种异黄酮糖苷的微生物合成。
当前47.60 mg/L的摇瓶产量距离工业化生产仍有差距，原文摘要未提及发酵罐放大实验或进一步的产量优化策略。未来可在以下方向深化：一是通过更精细的代谢网络调控提升DEIN内源供给，减少对外源前体的依赖；二是利用蛋白质工程提高P450酶的表达水平与催化效率，解除可能的限速步骤；三是结合发酵工艺优化，实现高密度培养下的产物高效积累。该研究为黄芪质量标志物的微生物制造开辟了可行路径，也为其他高价值异黄酮的完整生物合成提供了可借鉴的范例。
参考来源
Zhang W, Xu M, Wang L, Qiao X, Yang S. Efficient, complete biosynthesis of isoflavonoid calycosin-7-glucoside by metabolically engineered yeast cell factories. Front Bioeng Biotechnol. PMID: 42495113.
PMID: 42495113