来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是极具潜力的可再生资源，但其生物转化常面临低pH、高温及发酵抑制物等多重胁迫。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，基于其内源 SED1 基因构建了细胞表面展示系统，成功将 β-葡萄糖苷酶固定于细胞表面。展示菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在木质纤维素发酵抑制物存在下仍保持生长能力。这是首次在 I. orientalis 中实现功能蛋白的细胞表面固定化。
研究背景
气候变化与石油资源枯竭加速了对非化石基可持续生产体系的需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因其储量丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB 主要由纤维素（占总量 40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，前两者可经化学和酶处理水解为可发酵单糖，再由工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母是 LCB 生物转化中极具优势的宿主，具有抗噬菌体感染、易于遗传操作和异源蛋白表达能力强等特点。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。LCB 的酸性热化学预处理会营造低 pH、高温且含发酵抑制物的严苛培养条件，因此，展示纤维素酶的宿主菌株必须具备对这些胁迫的卓越耐受性。本研究采用具有突出多胁迫耐受性的非常规酵母 I. orientalis，并尝试在其中建立细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌 Escherichia coli NovaBlue 菌株（Novagen，美国威斯康星州）用作重组 DNA 操作宿主。E. coli 转化子在 Luria-Bertani 培养基（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、5 g/L 氯化钠）中、添加 100 µg/mL 氨苄青霉素、37 °C 条件下培养。本研究所用 I. orientalis 野生型菌株共 11 株，购自 NITE 生物资源中心（NBRC，日本东京）；所用 S. cerevisiae 野生型菌株为 BY4741（Life Technologies，美国加州）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表 S1。酵母生长培养基为酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L 酵母提取物、20 g/L Bacto-蛋白胨 [Difco Laboratories，美国密歇根州]、20 g/L 葡萄糖）、缺尿嘧啶的合成完全（SC-URA） dropout 培养基（6.7 g/L 无氨基酸酵母氮碱 [Difco Laboratories]、1.92 g/L 无尿嘧啶酵母合成 dropout 培养基补充物 [Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、20 g/L 葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L 无氨基酸酵母氮碱 [Difco Laboratories]、20 g/L 葡萄糖）。
I. orientalis NBRC1664 的胁迫耐受性分析
为分析低 pH 和高温耐受性，将 I. orientalis 和 S. cerevisiae 细胞在 3 mL YPD 培养基中、30 °C、200 rpm 预培养 48 h，然后以初始 OD600 0.05 接种至 5 mL SC 培养基。SC 培养基初始 pH 分别用 1 M HCl 和 0.5 M KOH 调至 2 或 6。使用 Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，日本东京）在 L 形管中、30 °C 或 45 °C、40 rpm 条件下培养 72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF 和香兰素）的耐受性，将细胞在 3 mL YPD 培养基中、30 °C、200 rpm 预培养 24 h。用 Milli-Q 水制备系列稀释液（OD600 为 1、0.1、0.01 或 0.001），各取 3 µL 点样于补充了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸及一种抑制物（糠醛 21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素 10 mM）的 SD 琼脂平板。平板在 30 °C 培养 96–120 h，用凝胶成像系统 FAS-X（Nippon Genetics，日本东京）记录菌落生长情况。
I. orientalis NBRC1664 尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，日本大阪）提取 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA。I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂分别用 URA3-UP-F/URA3-UP-R 引物和 URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R 引物经聚合酶链式反应（PCR）扩增（Xiao et al. 2014）。这些片段通过重叠延伸 PCR 融合，所得 DNA 片段导入 NBRC1664。转化子在补充 1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的 SC 琼脂平板上筛选。用 Colony-P-F 和 Colony-P-R 引物通过菌落 PCR 确认 IoURA3 ORF 的缺失。为验证尿嘧啶营养缺陷型，将转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的 SD 琼脂平板上划线，30 °C 培养。
细胞表面展示 cassette 的构建
所有质粒均使用 In-Fusion 试剂盒（TaKaRa Bio，日本滋贺）按制造商说明构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表 S2 和 S3。
IoURA3 基因的 DNA 片段用 URA3-F 和 Colony-P-R 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 经 PCR 扩增。扩增片段导入酵母着丝粒穿梭载体 pRS415 的 HindIII 位点，得到 pVT。涉及增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示的基因表达 cassette（来自质粒 pleGFP-SSS，Inokuma et al. 2020）用 ScSED1p-F 和 ScSAG1t-R 引物经 PCR 扩增，然后导入 pVT 的 SacI 位点，得到质粒 pVT-SceGFP。
IoSED1 编码区（除其分泌信号外，表 S4）用 IoSED1a-F1 和 IoSED1a-R1 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 经 PCR 扩增。扩增片段与用 Vector-F 和 Vector-R 引物、以质粒 plBG-SSS（Inokuma et al. 2016）为模板经 PCR 产生的 DNA 片段融合。所得质粒命名为 plBG-SSIoS，其中 plBG-SSS 的锚定结构域被替换为 IoSED1 锚定结构域。用于以 IoSED1 启动子、分泌信号和锚定结构域展示 eGFP 的质粒构建如下：含 IoSED1 启动子和分泌信号的 DNA 片段用 IoSED1ps-F1 和 IoSED1ps-R1 引物从 I. orientalis NBRC10737 基因组 DNA 经 PCR 扩增；eGFP 编码区 DNA 片段用 eGFP-F 和 eGFP-R 引物从 pleGFP-SSS 经 PCR 扩增；编码 IoSED1 锚定结构域的 DNA 片段用 IoSED1a-F2 和 IoSED1a-R2 引物从 plBG-SSIoS 经 PCR 扩增。这三个片段导入 pVT 的 SacI 位点，生成质粒 pVT-IoeGFP。
能够将基因导入 I. orientalis NBRC1664 第 2 号染色体先前鉴定的基因间位点 IS2（Lee et al. 2022）的整合型质粒构建如下：IS2 上游和下游约 1 kbp 的 DNA 片段分别用 IS2-UP-F/IS2-UP-R 引物和 IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 扩增。在 IS2-UP-R 的重叠区域插入了一个 PacI 识别位点。这两个 DNA 片段通过重叠延伸 PCR 融合，获得中心含一个 PacI 位点的 DNA 片段。该片段导入 pVT 的 PpuMI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS。pVT-IoeGFP 中用于展示 eGFP 的基因表达 cassette 用 IoSED1p-F 和 ScSAG1t-R 引物经 PCR 扩增，所得片段导入 pVT-IS 的 SacI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS-IoeGFP。
用于展示 A. aculeatus BGL1 的整合型质粒构建如下：IoSED1 启动子和分泌信号及 IoSED1 锚定结构域的 DNA 片段分别用 IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2 引物和 IoSED1a-F2/IoSED1a-R2 引物从 pVT-IoeGFP 扩增。编码 A. aculeatus BGL1 的 DNA 片段用 BGL-F 和 BGL-R 引物从 plBG-SSS 经 PCR 扩增。这三个片段导入 pVT-IS 的 SacI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示 eGFP 的 I. orientalis 菌株，将携带 eGFP 展示 cassette 的附加型质粒 pVT-SceGFP 或 pVT-IoeGFP 导入 NBRC1664/ura3Δ 菌株，分别得到 16-ScGFP-p 和 16-IoGFP-p 菌株。空载体 pVT 同样导入 NBRC1664/ura3Δ 菌株，得到 16-pVT 菌株。对于 eGFP 展示 cassette 的基因组整合，将整合型质粒 pVT-IS-IoeGFP 用 PacI 线性化后整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株的 IS2 位点，得到 16-IoGFP-int 菌株。类似地，为构建展示 BGL 的 I. orientalis 菌株，将整合型质粒 pVT-IS-IoBGL 用 PacI 线性化后整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株的 IS2 位点，得到 16-IoBG-int 菌株。
所有 I. orientalis 菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照先前报道（Xiao et al. 2014）并略作修改。酵母细胞在 3 mL YPD 培养基中、30 °C、200 rpm 过夜培养。取等分试样接种至 3 mL 新鲜 YPD 培养基中，继续培养至对数中期，随后收集细胞进行转化。
研究结果
I. orientalis NBRC1664 胁迫耐受性的评估
为比较 I. orientalis 与模式酵母 S. cerevisiae 的多胁迫耐受性，我们评估了从 NBRC 获得的 11 株 I. orientalis 中耐受性最强的 NBRC1664（图 S1）与 S. cerevisiae BY4741 在低 pH、高温和木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图 1a 所示，两个物种在 pH 6 条件下均生长良好，但 I. orientalis 生长优于 S. cerevisiae。I. orientalis 在 pH 2 条件下表现出稳健生长，72 h 后的 OD600 与 pH 6 条件下几乎相同；而 S. cerevisiae 在 pH 2 条件下无法生长。类似地，I. orientalis 在 45 °C 下成功生长而 S. cerevisiae 不能；两个菌株在正常温度 30 °C 下均生长良好（图 1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM 糠醛、28 mM 5-HMF 和 10 mM 香兰素）存在下的生长情况，进行了点样实验（图 1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的范围内（Mills et al. 2009）。在补充适当营养物的 SD 培养基上、非胁迫条件下，两个物种均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis 在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而 S. cerevisiae 在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与 Akita 和 Matsushika（2024）的报道一致。综上，这些结果表明 I. orientalis NBRC1664 具有卓越的多胁迫耐受性。
展示 eGFP 的 I. orientalis 菌株的评估
为确定与 GPI 锚定结构域融合的蛋白质能否固定在 I. orientalis 细胞表面，我们构建了 eGFP 展示基因表达 cassette，并通过荧光显微镜检查 eGFP 信号的定位。首先，尝试表达先前已显示可在 S. cerevisiae 细胞表面展示 eGFP 的基因表达 cassette（Inokuma et al. 2020），该 cassette 由 S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定结构域以及 S. cerevisiae SAG1 终止子组成（图 2a）。携带该 cassette 的附加型质粒（pVT-SceGFP）导入 I. orientalis NBRC1664/ura3Δ 菌株——一种尿嘧啶营养缺陷型菌株，其尿嘧啶营养缺陷型已通过生长分析确认（图 S2）——并按"材料与方法"部分所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到 eGFP 信号（图 2b）。
接下来，我们假设缺乏荧光是由于 cassette 中异源遗传元件在 I. orientalis 中功能不佳所致。细胞表面展示 cassette 的启动子、分泌信号和锚定结构域对展示效率有重要影响（Inokuma et al. 2014, 2016; Zhang et al. 2013）。因此，我们构建了一个修饰型展示 cassette，将这些元件分别替换为 IoSED1 基因的相应元件（图 2a）。IoSED1 与 ScSED1 基因同源（Kitagawa et al. 2010），且根据 big-PI Fungal Predictor 等预测工具（Eisenhaber et al. 2004）预测编码 GPI 锚定蛋白。此外，源自 IoSED1 基因的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa et al. 2010）。将这一新构建的展示 cassette 导入 NBRC1664/ura3Δ 后，荧光显微镜观察到清晰的表面定位荧光（图 2b）。荧光模式与 eGFP 展示的 S. cerevisiae 菌株中观察到的模式相当（Inokuma et al. 2020），表明 eGFP 成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
尽管检测到表面定位的 eGFP 信号，但仅在有限数量的细胞中观察到荧光。为提高展示 eGFP 的细胞比例，我们将展示 cassette 整合至基因组。按"材料与方法"部分所述构建了设计用于将 cassette 插入 I. orientalis NBRC1664 的 IS2 位点（Lee et al. 2022）的整合型质粒，并将 eGFP 展示 cassette 整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，具有清晰表面定位信号的细胞比例大大增加（图 2b），这与流式细胞术结果一致（图 S3）。综合来看，这些结果证明成功构建了能够在 I. orientalis 细胞表面展示目标蛋白的基因表达 cassette。
展示 β-葡萄糖苷酶的 I. orientalis 菌株的评估
接下来，利用所构建的蛋白质细胞表面展示基因表达 cassette，我们构建了展示 A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao et al. 1988）的 I. orientalis 菌株，命名为 16-IoBG-int（图 3a）。该菌株在 YPD 培养基中、30 °C 培养 72 h，随后在 30 °C 下评估细胞组分和培养上清液中的 BGL 活性。16-IoBG-int 及其亲本菌株的培养上清液中均未检测到 BGL 活性。相比之下，16-IoBG-int 的细胞组分表现出显著更高的 BGL 活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图 3b）。这表明 BGL 成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1 在 LCB 生物转化中预期的高温条件下的活性（Yanase et al. 2010），将在 30 °C 培养 72 h 的细胞在 45 °C 下进行相同的 BGL 活性测定。在 45 °C 下测定时，BGL 活性显著增加至 30 °C 测定值的 3 倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图 3c）。这一结果与 A. aculeatus BGL1 的最适温度处于 50 °C 以上的高温范围这一事实一致（Murao et al. 1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的 BGL 展示菌株是否能以纤维二糖为唯一碳源生长，将 16-IoBG-int 菌株在含 1.9% 纤维二糖和 0.1 M MOPS（pH 6.5）的 SC 培养基中培养。16-IoBG-int 菌株表现出稳健生长，而亲本菌株 NBRC1664/ura3Δ 几乎无法生长（图 4a）。培养 72 h 后，培养基中残留纤维二糖浓度显著降低（图 4b），表明纤维二糖被有效水解并同化。
进一步评估了该菌株在木质纤维素发酵抑制物存在下以纤维二糖为唯一碳源的生长能力。在含 25.4 mM 5-HMF 或 100 mM 乙酸（两者均为木质纤维素水解液中的典型抑制物）的培养基中，16-IoBG-int 菌株仍能维持生长（图 4c、4d）。这些结果表明，展示 BGL 的 I. orientalis 菌株能够在与 LCB 生物转化相关的胁迫条件下同化纤维二糖。
讨论与解读
本研究开发了一种适用于多胁迫耐受型酵母 I. orientalis 的细胞表面展示 cassette。利用该 cassette，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1 的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且能在多种与 LCB 生物转化相关的胁迫条件下同化纤维二糖。这表明携带纤维素酶的 I. orientalis 菌株非常适合高效的 LCB 生物转化。
研究发现，采用源自 IoSED1 基因的启动子、分泌信号和锚定结构域构建的新基因表达 cassette 可成功展示 eGFP。基因组整合 cassette 与附加型质粒表达系统相比，显著提高了细胞表面显示 eGFP 荧光的细胞比例，表明质粒-based 表达在 I. orientalis NBRC1664 中本质上不稳定。这一解释与先前报道一致——携带相同 S. cerevisiae 来源着丝粒和自主复制序列的附加型质粒在另一株 I. orientalis 菌株中表现出不稳定性（Tran et al. 2019; Cao et al. 2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍观察到一部分非荧光细胞（图 2b 和图 S3）。值得注意的是，如图 2b 所示，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光，这可能与细胞周期或细胞壁结构差异有关，原文未详述。
编译者解读
该研究的关键价值在于将细胞表面展示技术从模式酵母拓展至工业潜力更大的多胁迫耐受型非模式酵母。选择 I. orientalis 作为底盘，直接回应了木质纤维素生物转化中"菌株耐受性不足"这一瓶颈——与其改造酿酒酵母的耐受性，不如直接利用天然耐受宿主。方法上的亮点是"本土化"策略：当酿酒酵母来源的展示 cassette 失效时，果断替换为宿主内源 SED1 元件，这提示异源表达系统中"元件来源匹配"比"元件功能已知"更重要。基因组整合策略有效解决了质粒不稳定的问题。局限在于：展示效率仍非均一（部分细胞不显示荧光），且目前仅验证了单酶展示，距离纤维素降解所需的多种酶共展示仍有距离。未来若能在该平台实现纤维素酶混合物（如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶与 BGL）的共展示，将更接近"整合式生物加工"（CBP）的实用目标。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235