来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
纤维素酶的原位生产是提升第二代生物乙醇工艺效率与可持续性的关键策略，但固态发酵（SSF）在放大过程中长期受困于传热、反应器操作与下游处理等瓶颈。本研究以嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b 为产酶菌株，在多层填充床生物反应器中系统评估了批式与连续操作模式下内切葡聚糖酶的集成化生产、提取、回收与稳定化工艺。以甘蔗渣与麦麸（7:3 w/w）为底物，45°C 发酵 96 h，连续模式显著提升了各模块间的酶活均一性。硫酸铵沉淀法回收率达 78.7%，酶活达 156 U·g.d.s⁻¹，凸显了过程集成对工业化应用的支撑价值。
研究背景
循环生物经济主张将有机副产物转化为能源、生物材料与高值生物产品，木质纤维素生物精炼厂在此框架下成为关键平台。第二代生物乙醇（2G 乙醇）的经济可行性高度依赖于高效纤维素酶的可获取性，而原位产酶策略被视为降低对外部商品酶制剂依赖、增强生物精炼厂酶自给能力的战略途径。固态发酵（SSF）因能直接利用农工副产物为底物、较液体发酵大幅降低水耗，与循环生物经济原则高度契合，近年来受到广泛关注。在多种反应器构型中，填充床系统因设计简单而颇具吸引力，但传热不良与床层过热问题仍是其放大应用的主要障碍。
研究方法
微生物与底物
产纤维素酶菌株为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b。该菌株最初分离自巴西 Usina Guarani（Olímpia, SP, Brazil）的甘蔗渣堆，前期摇瓶与生物反应器实验已证实其具有优异的纤维素酶生产能力。
接种物制备：将菌株培养于含 60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的锥形瓶斜面琼脂中，在生化需氧量培养箱（BOD，Model SL 200，Solab，Brazil）中 45°C 培养至少 48 h，以促进菌丝生长与产孢。培养结束后，用 100 mL 无菌营养溶液轻轻刮取琼脂表面以收集孢子。该营养溶液 pH 调至 5.0，组成如下（w/v）：0.35%（NH₄）₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂ 和 0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化至每克干固体（g.d.s）含 1 × 10⁷ 个孢子。
固体底物选用甘蔗渣（SCB）与麦麸（WB），二者成本低廉、区域供应充足，且能为固体基质提供有利的营养与结构条件。SCB 由 Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.（Brazil）提供，WB 购自当地供应商（Agropecuária Claro，São Carlos，SP，Brazil）。SCB 预先在对流烘箱（Model 035，Marconi，Brazil）中 60°C 干燥，直至含水量降至 10–15%，含水量使用水分分析仪（M5 Thermo，Bel Engineering，Monza，Italy）测定。干燥后过筛，筛孔尺寸为 5 × 5 mm 与 4 × 2 mm。麦麸直接使用，含水量 12%（湿基），平均粒径不超过 1.8 mm。
填充床生物反应器中的固态发酵
SSF 实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长 10 cm、内径 13 cm、外径 15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，实现床层温度控制，缓解填充床 SSF 中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供给，依次经过针阀、生物过滤器与 AppliTech® 流量计（Asa，Italy），随后导入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间隙充填维持操作温度的蒸馏水，以在空气进入反应器前促进其饱和——该策略旨在最大程度减少 SSF 过程中床层的过度干燥。反应器出口处，渗透气体经过除湿系统，该系统由连接接收瓶的冷凝液收集器与一根直径 5.2 cm、高 39 cm 的硅胶柱组成。该装置将出口空气相对湿度降至 15% 以下，以满足使用 Vaisala Carbocap 探头（Vantaa，Finland）准确测定 CO₂ 浓度的要求。
反应器垂直放置，包含入口模块（IL）与出口模块（OL），二者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部为锥形几何结构。运行期间空气自下而上通过固定床。位于系统底部的入口模块（IL）填充玻璃珠以促进空气均匀分布，出口模块（OL）留空以利于气体流动。此外，两个辅助模块分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）与干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块中水分的过度散失并吸收出口模块壁面凝结的水分。每个辅助模块填充 90 g 粗 SCB。
操作温度维持在 45°C——该温度已被报道为 M. thermophila 产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间为 96 h。实验期间，过程空气与循环水均通过模块和加湿器夹套中的水循环维持在 45°C，由恒温水浴（model SL-152，Solar，Brazil）供给；渗透空气流量固定为 250 L h⁻¹，以增强氧传质并维持整个床层适宜的湿度条件。
发酵温度曲线通过安装在每个发酵模块进出口法兰处的 T 型热电偶随时间监测。传感器尖端位于各模块的径向中心，可全程监测床层内部温度演变。信号由 National Instruments COMPAQ-DAQ 数据采集系统记录，运行基于 LabVIEW 软件（National Instruments，Austin，USA）开发的程序。
模块的添加、移除与重新定位过程中，固体底物会短暂暴露于实验室环境。但所有操作均在无菌条件下进行以最大程度减少微生物污染。底物与营养溶液分别在高压灭菌锅中 121°C 灭菌 20 min。冷却后，各组分在经紫外辐射灭菌的超净工作台中与孢子悬浮液混合均匀。空气过滤器与加湿装置在每次发酵前同样经过灭菌。
发酵培养基采用 SCB 与 WB 按 7:3（w/w）比例混合，与 M. thermophila I-1D3b 的前期研究一致。含水量通过添加营养溶液与接种物悬浮液调整至 75%（湿基），接种量足以提供每克干固体 1 × 10⁷ 个孢子。每个发酵模块填充 130 g 干底物。
操作模式
为评估操作模式（批式与连续）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，其中连续操作分别采用上行与下行模式。
批式培养中，PBB 在发酵开始时即组装全部发酵模块，并保持相同构型直至 96 h 终点。该条件作为与连续模式实验比较的参照。4 天发酵使用四个发酵模块，分别标记为 L1、L2、L3 和 L4。
连续模式下，模块每 24 h 逐个添加，经过接种、装填与耦联至 PBB 的步骤。初始阶段床层高度逐渐增加，直至最先插入的模块达到规定的停留时间。此后进入稳态操作，其特征为发酵成熟模块的取出与新接种模块的添加同步进行。根据操作策略，模块运动方向为上行（底部进料、顶部出料）或下行（顶部进料、底部出料）。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控仍是填充床生物反应器操作的主要技术挑战之一，因为代谢热的积累可能损害酶稳定性与发酵过程的均一性。本研究考察了批式与连续操作模式对 Myceliophthora thermophila I-1D3b 在木质纤维素底物（SCB:WB，7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3显示了批式操作、上行连续操作与下行连续操作下四个发酵模块中监测到的温度随时间演变。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度保持在 45°C 附近，各监测点间差异小于 4°C。批式操作下，初期温度升高，随后出现热峰，之后趋于稳定或略有下降——这一行为与固定床系统中代谢热的瞬时积累一致。轴向热梯度的形成与单向通风内在相关，并可通过温度沿反应器长度的分散程度得到证实。尽管过热程度轻微，但梯度的持续存在可能影响床层内的氧传质与蒸发速率。
连续操作下（图3b 和 c），热曲线较批式模式呈现更频繁的波动，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在这些波动，温度仍保持在与批式操作相似的范围内，未观察到明显的热过热现象。在 96 至 210 h 之间，每 24 h 添加与移除一个模块，系统以模块沿柱体逐级推进的方式运行，其行为接近活塞流反应器。该解释与 Mitchell 等人的观点一致，即连续 PBB 操作可能促进床层沿程过程条件的更大均匀性。
各操作模式间的最高温度与平均温度相近：峰值温度分别为 48.2 ± 0.6°C（批式）、48.9 ± 0.7°C（上行连续）与 47.8 ± 0.8°C（下行连续），平均温度分别为 44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4 与 44.5 ± 0.5°C，各模式间无显著差异（p > 0.05）。上述结果表明，在本研究条件下，两种操作模式均使系统维持在接近目标温度范围内，未出现严重过热。
温度维持在接近最适值的范围内，说明高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及所采用的模块移动策略共同促进了代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为 0.764，高于 Perez 等人在含甘蔗渣与麦麸系统中报道的 0.55——后者在孔隙率 0.55 时观察到约 3°C 的温升。相比之下，Ghildyal 等人在 PBB 中以 Aspergillus niger 培养于麦麸时报道了 15°C 的温升。综合比较进一步证实，床层物理结构在固态发酵的热消散与热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置同样影响反应器热曲线。图3c 显示了新接种模块从反应器上部加入时连续发酵的热行为。该构型下，热峰集中于 PBB 上部区域，与图3b 中最高峰出现在床层下部与中间区域的特征形成对比。该差异表明，新接种模块所处位置直接影响系统内热量的空间分布。
在图3c 中，每 24 h 记录到的温度下降反映了模块添加、移除与移动的时刻，体现了连续操作间歇性运行的特征。由于新模块从发酵区上部位置插入，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间呈现较小的热波动。该行为表明模块进料策略改变了 PBB 中的纵向热分布，因此在系统操作设计时应予以考虑。然而，由于与下游系统集成的操作限制，本研究中后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
在批式与上行连续操作下评估了内切葡聚糖酶活性与发酵模块的最终含水量，结果见图4a、b 及表1。这些变量的控制对 PBB 性能至关重要，因为低于 10% 的水热梯度即可能使酶生产率降低 30–50%。
批式与连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相近，分别为 95.63 ± 28.37 与 96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相近，但连续过程中观察到的较低离散度表明各发酵模块间的酶活空间均一性更高。因此，两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性，而非平均产酶水平。
连续操作下的高均一性与批式模式下更大的离散度形成对比——后者可归因于静态系统特有的局部水分、温度与氧可用性异质性。从操作角度看，更高的均一性意味着更强的过程稳健性与可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间推移均暴露于热梯度和湿度梯度的各个区域。根据 Mitchell 等人的观点，连续操作下 PBB 趋向于接近活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相与热条件。
这些结果与 Rodrigues 等人的报道一致——他们同样观察到 M. thermophila I-1D3b 在 PBB 中以 SCB:WB 7:3（w/w）底物连续发酵时内切葡聚糖酶活性具有更高的均一性。
除酶活外，床层含水量也是系统运行的关键因素，因为水分含量降低会直接损害 SSF 中真菌的生长与代谢活性。固体基质最终含水量（湿基百分比，% w.b.）见表1。
CO₂ 浓度曲线
连续操作中每 24 h 添加和移除一个模块，使系统在稳态下运行，同时各模块处于不同的发酵阶段。图5显示了批式与连续模式下 PBB 出口气流中 CO₂ 浓度的平行测定结果。
批式操作中，CO₂ 浓度曲线呈现典型的先升后降趋势，与微生物生长和代谢活动的阶段性变化一致。连续操作中，CO₂ 曲线呈现周期性波动模式，与模块的定期添加和移除相对应，反映了系统中活跃生物量的动态平衡。
连续操作下的酶回收
图6显示了连续操作下各模块获得的内切葡聚糖酶活性与回收率。提取流量分别为（a）180 L h⁻¹ 与（b）2400 L h⁻¹。下标"E"表示通过渗透回收的酶活，无下标数值表示渗透后固体经补充提取得到的残余酶活。
提高渗透水流量显著增强了酶回收效率，表明传质是下游处理性能的关键限制因素。
顺序渗透提取循环
图7显示了从 Myceliophthora thermophila I-1D3b 发酵底物（甘蔗渣:麦麸，7:3 w/w）中每个顺序渗透提取循环回收的内切葡聚糖酶活性。柱形代表平均值 ± 标准差（n = 3）。不同字母表示 Tukey 检验差异显著（p < 0.05）。
酶浓缩与稳定化
图8显示了内切葡聚糖酶活性与（a）硫酸铵饱和度、（b）乙醇浓度的关系，以及（c）60% 与 70% 饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学。
酶学提取物表征显示，最大酶活在 60°C 与 pH 4.0 条件下获得，证实了该酶具有适合工业应用的嗜热嗜酸特性。硫酸铵沉淀法优于乙醇沉淀法，从粗提物中回收了总酶活单位的 78.7%，酶活达 156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在评估条件下导致显著的酶活损失。
讨论与解读
本研究证实了 Myceliophthora thermophila I-1D3b 以甘蔗渣与麦麸为底物、在多层填充床生物反应器中以批式与连续两种模式进行固态发酵产内切葡聚糖酶在技术上可行且可重复。连续操作降低了床层内异质性，促进了各发酵模块间酶活的更大均匀性，且未牺牲相对于批式操作的平均产量水平。热曲线保持在物种最适范围附近，最高温度分别为 48.2°C（批式）与 48.9°C（连续），表明连续操作未损害系统稳定性。在评估的浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优异，回收率达 78.7%，酶活为 156 U·g.d.s⁻¹，而乙醇在测试条件下导致酶活净损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，在 60°C 下保温 24 h 后仍保留约 92% 的活性。综合来看，热控制、渗透提取与下游处理的集成对于该平台在第二代乙醇链中原位生产纤维素酶的稳健性与适用性至关重要。未来研究应在中试规模验证这些条件，并探索互补的纯化策略。
编译者解读
该研究最值得关注之处在于将反应器操作策略与下游回收工艺作为整体系统进行优化——连续模式下模块的"移动式培养"天然实现了不同发酵阶段的并行处理，这一设计巧妙回避了传统 SSF 放大中"均一性"与"吞吐量"的两难。硫酸铵沉淀相较乙醇的显著优势也提示，在富含多糖与色素的实际底物提取液中，沉淀剂的选择需以实验数据为准而非照搬教科书方案。局限在于本研究聚焦内切葡聚糖酶单一活性，对纤维素酶复合体系中其他组分（如 β-葡萄糖苷酶）的行为未及展开；此外，连续模式虽提高了空间均一性，但酶活绝对水平并未超越批式——"更均匀"是否足以抵消操作复杂度的增加，仍需经济性评估给出答案。
PMID: 42370983