来源：核酸提取A260/230低胍盐残留（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
开篇导语
核酸提取做完，A260/280挺漂亮，A260/230却掉到1.2，你敢直接送qPCR吗？这个比值低，常见元凶就是胍盐残留，也可能被洗液、上样量、空白和操作坑了。下面按“先排低级错、再拆流程、后啃疑难”走一遍，给你能直接照做的判断、验证和解决动作。覆盖柱式DNA/RNA提取，参数按常规200 µL样本给。
第一步：快速排查低级错误
1. Wash Buffer II 没加乙醇，或乙醇加错浓度。 直接看瓶身刻度：多数试剂盒要求按标签加入100%乙醇至80%工作浓度，少加一次，盐就洗不干净；重新按说明书配，瓶上写“已加乙醇”和日期。
2. 忘做空柱离心和开盖干燥。 膜上残乙醇和盐会一起进洗脱液；空柱12,000 g离心2分钟，开盖56°C放3-5分钟，别烤过头。
3. 洗脱液、枪头或比色皿污染。 换新TE pH 8.0，用同一批枪头，NanoDrop基座先用70%乙醇擦、再用水擦，空白用洗脱液。
4. 上样量过大，裂解液太黏。 组织超过20 mg或细胞超过5×10^6，柱子容易过载；减半上样，或分两根柱子过。
第二步：分维度系统排查
1. 裂解不彻底，胍盐抱团进柱子。
现象： 裂解液发黏、有颗粒，洗脱产量不低，A260/230只有0.8-1.2。
原理： 胍盐裂解液没把核酸释放干净，黏稠体系会把盐和蛋白一起带进硅胶膜，230 nm吸收压不住。
解决： 200 µL样本加20 µL Proteinase K，56°C孵育30分钟，每10分钟涡旋5秒；组织先剪碎，加200 µL含胍盐裂解液后充分混匀。
验证： 裂解液应清亮、无组织块；取5 µL点板看无黏丝，再继续加乙醇。
2. 结合步骤乙醇比例不对，盐没被“冲开”。
现象： 洗脱体积正常，A260/230低，A260/280尚可。
原理： 柱式提取靠乙醇把核酸压上膜，乙醇少了结合差，乙醇多了盐易残留；胍盐在230 nm有强吸收。
解决： 200 µL裂解液加200 µL 100%乙醇，枪头吹打10次，室温放5分钟；每次转柱不超过700 µL，8,000 g离心30秒，分两次上完。
验证： 看流穿液体积是否接近上样量；若柱子滴液很慢，说明黏度太高，回去减上样量。
3. 洗涤次数不够，Wash I/II 顺序用反。
现象： 230 nm处有肩峰，A260/230常低于1.5，重复样本忽高忽低。
原理： Wash I通常去蛋白和盐，Wash II含乙醇去盐；少洗一次或把Wash II当Wash I用，胍盐直接留膜上。
解决： 加500 µL Wash I，12,000 g离心30秒；加600 µL Wash II，12,000 g离心30秒，重复一次Wash II；空柱12,000 g离心2分钟。
验证： 洗后取流穿液1 µL测A230，应接近空白；若仍高，再加洗一次Wash II。
4. 干燥不足或干燥过度，盐和乙醇两头坑。
现象： 洗脱液闻着有乙醇味，A260/230低；或产量突然掉。
原理： 乙醇残留会干扰酶反应，盐残留抬高230吸收；烤太干膜会 irreversibly 吸附核酸。
解决： 空柱离心后开盖56°C放3分钟；不要超过5分钟。洗脱前可室温再放2分钟。
验证： 洗脱液无酒味；A260/230复测应回到1.8以上，RNA到2.0以上更稳。
5. 洗脱体积太小，污染物被浓缩。
现象： 产量看起来高，A260/230却低，稀释5倍后比值变好。
原理： 30 µL以下洗脱时，膜上残余胍盐和乙醇被浓缩，230吸收被放大。
解决： 用50 µL预热至65°C的TE pH 8.0洗脱，室温孵育2分钟，12,000 g离心1分钟；不要用20 µL硬洗。
验证： 同一柱再洗一次，第二管A260/230通常更高；若第二管产量仍高，说明第一次没洗透。
6. 定量空白和基座污染，假性低比值。
现象： 同一样本两次测差很多，230 nm整段抬高。
原理： 空白液与洗脱液不匹配，或基座残留胍盐，会把230吸收算进去。
解决： 基座用70%乙醇擦2次、无尘纸擦干，空白用同批TE；上样1.5 µL，浓度超1,000 ng/µL时用TE稀释5倍复测。
验证： 用Qubit或荧光定量交叉核对；若Nano