来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
核黄素（维生素B2）生物合成中的核黄素合酶（RS）/6,7-二甲基-8-核糖醇基黎芦嗪合酶（LS）复合物是研究酶封装策略的天然模型：一个由60个亚基组成的十二面体LS笼状结构，内部精准封装一个同源三聚体RS。然而，这种3:1的宿主-客体化学计量比是如何实现的，其分子机制一直悬而未决。本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Aquifex aeolicus来源的AaRS/AaLS包含物复合体结构，揭示了一套层级化组装机制——包括多价锚定、构象门控和分子锁——共同确保了精确的封装比率。
研究背景
将代谢酶隔离在蛋白质区室内是细胞优化代谢反应的一种普遍策略。通过物理屏障控制分子通量，这些外壳能够建立高浓度的催化剂和中间体局部环境，提高通路效率并减少副反应。蓝藻中的羧酶体是典型例子——蛋白质外壳封装核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）和碳酸酐酶，以克服RuBisCO的低周转率和底物特异性差的问题。在这类系统中，外壳蛋白与客体酶的适当比例对形态和反应通量至关重要。
核黄素合酶/黎芦嗪合酶复合物是某些细菌中维生素B2生物合成的蛋白质区室。由LS形成的十二面体笼催化核黄素生物合成的倒数第二步，其内部封装的同源三聚体RS则催化下一步反应。这种天然的宿主-客体系统为合成生物学中设计可编程化学计量控制的人工催化区室提供了设计原理，但其分子基础长久以来未能阐明。
研究方法
材料 — 所有盐类和缓冲液组分购自Merck-Millipore（美国马萨诸塞州伯灵顿）、New England BioLabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）或Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），除非另有说明。寡核苷酸由Merck-Millipore合成。大肠杆菌菌株BL21-Gold(DE3)和DH5α感受态细胞分别购自Agilent（美国加利福尼亚州圣克拉拉）和Thermo Fisher Scientific。质粒pMG_AaLS-wt、pACYC_Ptet_AaRS和pACYC_Ptet_sfGFP-AaRS196-207由Donald Hilvert教授（瑞士苏黎世联邦理工学院）惠赠。本研究中使用的所有蛋白质、质粒和寡核苷酸分别列于补充表4–6。
分子克隆 — 含单个丙氨酸替换的AaLS突变体质粒通过QuickChange聚合酶链式反应制备，以pET15_AaLS-wt-Strep67为模板，使用一对寡核苷酸FW_AaLS_XX和RV_AaLS_XX作为引物，其中XX对应引入的突变（补充表6）。编码BaLS、CtLS、HpLS、SaLS、TmLS或SoLS的密码子优化的LS基因（带C端Strep标签）以及编码BaRS、CtRS、HpRS、SaRS、TmRS或SoRS的RS基因，由GenScript Biotech B.V.（荷兰赖斯韦克）合成并分别通过NdeI/XhoI位点亚克隆至pET15或pACYC_Ptet载体。所有克隆步骤均使用大肠杆菌DH5α作为宿主菌。质粒序列由Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH（德国慕尼黑）通过DNA Sanger测序确认。
AaRS/AaLS复合物的生产与纯化 — 转化了pMG_AaLS-wt和pACYC_Ptet_AaRS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)-gold菌株在LB培养基（50 mL）中培养至OD600达到0.6–0.8，此时用0.2 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和5 µg/mL四环素诱导蛋白质生产。25 °C培养18–20小时后，5000 × g、4 °C离心10分钟收集细胞，保存于−20 °C直至纯化。细胞沉淀重悬于25 mL含200 mM NaCl的0.1 M磷酸钠（Na-Pi）缓冲液（pH 8.0），补充0.5 mg/mL溶菌酶和5 µg/mL DNase I。超声破碎后，9500 × g、25 °C离心25分钟去除不溶性组分。C端带His6标签的AaLS蛋白通过HisPur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）亲和色谱从所得上清中纯化。洗涤使用含200 mM NaCl和20 mM咪唑的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0），洗脱使用含200 mM NaCl和500 mM咪唑的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）。随后使用Amicon Ultra离心超滤管（50 kDa MWCO）将缓冲液置换为含200 mM NaCl和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）。所得溶液进行尺寸排阻色谱，使用Superose 6 increase 10/300柱（Cytiva），以含200 mM NaCl和5 mM EDTA的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）在室温（RT）下以0.75 mL/min流速运行。收集峰组分，浓缩，室温保存直至后续实验。蛋白质浓度通过280 nm吸光度测定，使用AaLS的消光系数（ε280 = 13,980 M⁻¹cm⁻¹）计算。蛋白质纯度及与AaRS的复合物形成通过考马斯亮蓝R350染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认。
仅含pMG_AaLS-wt质粒的细胞用0.2 mM IPTG诱导，采用相同方案生产和纯化单独的AaLS。对于单独的AaRS，仅含pACYC_Ptet_AaRS质粒的细胞用5 µg/mL四环素诱导，按上述方法进行细胞裂解。澄清裂解液经0.22 μm过滤后进行硫酸铵沉淀。沉淀蛋白离心收集，溶于10 mM Tris-HCl（pH 8.9），在PD-10柱（Cytiva）上脱盐，然后使用HiTrap Q HP柱（Cytiva）进行阴离子交换色谱纯化，用10 mM Tris-HCl（pH 8.9）中0–50%线性梯度的1 M NaCl洗脱。收集峰组分，缓冲液置换为10 mM Tris-HCl（pH 8.9），在Mono Q 5/50 GL柱（Cytiva）上进一步精纯。纯化后的蛋白随后在Superdex 200 Increase 10/300柱（Cytiva）上进行尺寸排阻色谱，柱平衡液为含200 mM NaCl和5 mM EDTA的50 mM Na-Pi缓冲液（pH 8.0）。收集峰组分，浓缩，用于质谱光度测量。
AaRS的质谱光度测量 — 测量在Refeyn Ltd. OneMP质谱光度计上进行。硼硅酸盐盖玻片（#1.5，24 × 50 mm²；Thorlabs）依次在超纯水、异丙醇和超纯水中超声清洗，并在氮气流下干燥。将干净的硅胶垫圈安装在盖玻片上，加入9 μL测量缓冲液用于对焦。纯化的AaRS用相同缓冲液稀释至约10–30 μg/mL，采集前立即加入1 μL稀释样品。以100帧/秒的速率记录影片，使用5×帧合并和4×像素合并，每次测量共采集100,000帧。原始数据在DiscoverMP v2.0.3中使用默认参数处理，启用平均和反射率校正，分子量分布从校准的对比度值获得。
冷冻电镜（cryo-EM）载网制备 — 纯化的LS笼用Amicon Ultra离心超滤管（30 kDa MWCO）浓缩至1 mg/mL，取3.5 μL样品施加到新鲜辉光放电的Quantifoil R2/1 Cu 200目载网上（Quantifoil Micro Tools GmbH，德国Großlöbichau）。对于AaRS/AaLS包含物复合体，使用0.5 mg/mL蛋白质和氧化石墨烯包被的载网。使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在100%相对湿度和4 °C条件下将载网在液态乙烷中快速冷冻。玻璃化参数包括等待时间30秒、总吸干次数2次、吸干力3、吸干时间3秒。
单颗粒重构的冷冻电镜数据采集 — 冷冻电镜影片数据集在波兰国家同步辐射中心（SOLARIS）的Titan Krios G3显微镜（Thermo Fisher Scientific）上采集，加速电压300 kV，标称放大倍数×105,000，校准像素尺寸0.8456 Å/像素。配备BioQuantum成像过滤器（20-eV狭缝）的K3直接电子探测器（Gatan，美国加利福尼亚州普莱森顿）以计数模式运行。成像区域暴露总剂量为40 e⁻/Ų，对应剂量率约16 e⁻/像素/秒。在0.9至2.1 μm的散焦值范围内以0.3 μm增量记录四十帧影片堆栈。每个数据集采集的影片数量为5,000至10,000张（补充图1和3）。采集的数据集使用cryoSPARC v4.5.3进行处理。
AaRS/AaLS包含物复合体的冷冻电镜单颗粒重构 — 一个包含8,625张影片的数据集使用patch motion correction和patch CTF estimation处理。随后的3D模板粒子拾取产生2,539,751个2×合并粒子，经2D分类后选出1,749,455个（占数据集的100%）（补充图1a）。在无对称性（C1）条件下进行从头重构，随后使用四面体（T）对称性进行均质3D精修，并松弛至C1对称性。得到的12-五聚体笼用于生成包裹组装体外壳的软3D掩膜。相应粒子随后在4 Å分辨率下进行四轮3D分类，分为十个类别，使用软掩膜。根据结构特征进行人工检查和粒子在类别间的重新分配，最终得到五组：具有二十面体（I）对称性的12-五聚体笼、一个…
研究结果
AaRS锚定在AaLS五聚体-五聚体界面 — 我们首先表征了AaLS和AaRS各自的四级结构，作为研究它们相互作用的基础。两种蛋白质均在大肠杆菌中异源生产并纯化用于结构表征。已知AaLS形成由60个原聚体组成的十二面体结构，本研究通过cryo-EM单颗粒重构也证实了这一点（图1b）。AaRS包含串联催化位点、一个卷曲螺旋结构域和CLS（图1c），预测形成同源三聚体，与大肠杆菌直系同源物的晶体结构类似，其中卷曲螺旋结构域介导三聚化。纯化AaRS的质谱光度分析验证了这一预测，显示表观分子量为67 kDa，与同源三聚体的理论质量（69 kDa）高度吻合（图1d）。这些结果证实重组AaLS和AaRS分别天然组装成十二面体和同源三聚体。
为表征AaRS/AaLS复合物，AaRS和Strep标签的AaLS在大肠杆菌中共表达，通过亲和和尺寸排阻色谱分离。SDS-PAGE分析确认共纯化（图1e），cryo-EM显示直径约16 nm的颗粒（图1f）。无对称性（C1）的三维重构在十二面体结构内部产生了显著的密度，表明AaRS成功封装（图1g）。然而，客体cryo-EM密度较弱且定义不清，特别是在预期的AaRS与AaLS之间的界面处，无法获得原子级相互作用信息。尽管测试了化学交联和各种重构策略（包括局部精修、对称性扩展和亚断层图平均），均未获得显著改善。持续较弱的客体密度提示AaRS在AaLS笼内存在构象异质性，而非结合到特定的腔内位点。
通过3D分类分析AaRS/AaLS复合物的cryo-EM数据时，我们发现相当大比例的颗粒由不完整的AaLS十二面体组成（补充图1和2）。这些结构缺少一到三个五聚体单元。相比之下，在相同条件下单独生产AaLS时，不完整组装体较少。具体而言，当存在AaRS时，仅42%的颗粒被分类为完整的12-五聚体组装体（补充图1a），而无客体货物时为80%（补充图3a）。这些发现表明与AaRS共生产阻碍了AaLS笼的完成。
不完整AaLS组装体的存在促使我们研究AaRS是否可能与缺失五聚体构建块的位置相互作用。由于该区域具有局部五重对称性，我们对11-五聚体颗粒施加C5对称性进行了3D重构。该策略揭示了归属于AaRS部分的清晰额外cryo-EM密度（图1h，红色，及补充图1b）。值得注意的是，该额外密度并非定位于腔内表面，而是位于AaLS五聚体-五聚体相互作用界面——即另一个五聚体对接后形成三重对称性的区域，以下简称"pre-C3"区域（图1i）。这种靶向正在组装的界面而非腔内表面的货物识别机制，在任何其他蛋白质区室中从未观察到。
同源三聚体AaRS呈现三个CLS肽段，而五边形孔提供五个潜在的pre-C3结合位点，表明并非所有结合位点都会被等效占据。为解析AaRS的排列方式，我们对11-五聚体颗粒进行了对称性扩展。所得密度图显示AaRS三聚体的两个CLS肽段占据五边形孔的相邻角落，而第三个CLS位于两者之间，不与AaLS表面接触（图1j和补充图1b）。在10-五聚体组装体中观察到相同的构型（图1k和补充图1c）。两种复合物中相同的结合模式提示AaRS招募发生在组装的早期阶段，捕获的10-和11-五聚体颗粒代表笼形成过程中相对丰富的晚期中间体。
五边形孔与AaRS三聚体的尺寸比较显示，客体货物需要完整笼至少缺失三个五聚体才能通过开口（补充图4a、b）。这提示大部分AaRS招募发生在早期到中期组装阶段之间，与AaRS三聚体结合10-和11-五聚体组装体的观察结果一致。同时，如果AaRS未能事先三聚化，单个单体可以通过较小的孔进入并在笼内三聚化（补充图4c），这可能提供了额外的化学计量控制层。
精修结构揭示了AaRS卷曲螺旋结构域作为主要组织单元的作用（图1l、m）。它跨越并将两个CLS肽段导向相邻的pre-C3结合位点，由此产生的多价性可能增强整体结合亲和力。为实现这种排列，两个CLS肽段在与卷曲螺旋的连接处采用不同的二级结构构象。一个CLS与卷曲螺旋保持几乎连续的α-螺旋，而第二个CLS的连接区含有用于位置调整的断裂（图1m）。这种结构不对称性，特别是非螺旋连接区，可能调节整体结合亲和力，使其足以锚定但不会完全阻断笼完成过程中最终五聚体的对接。
除CLS定位外，卷曲螺旋结构域还约束了腔内三个催化结构域的空间排列。催化结构域的cryo-EM密度不如CLS区域定义清晰（补充图2），且未鉴定到与AaLS外壳的大量接触。虽然卷曲螺旋表现出三重对称性，但催化结构域采用非对称排列（图1m），表明其结构域间连接具有灵活性。这些观察共同表明催化结构域主要通过卷曲螺旋和CLS肽段拴系在锚定结构上。尽管存在这种灵活性，完整的AaRS三聚体模型仍可自信地拟合到可用密度中，证明锚定位点的空间容纳单个同源三聚体（图1l和补充图5）。值得注意的是，该占据率留下的多余体积不足以容纳另一个AaRS三聚体。这种由卷曲螺旋结构域施加的空间组织可能防止组装过程中的客体过载。
AaRS-CLS的相互作用模式 — 仔细检查cryo-EM结构揭示了AaRS-CLS如何与AaLS五聚体界面结合（图2a–c）。AaRS-CLS采用两亲性α-螺旋，将氨基酸残基I200、F201、F204、L205和W207的侧链（图2a）朝向由两个AaLS原聚体的L26、L121和I125组成的pre-C3疏水表面（图2b）。AaLS的E122通过笼组装体内侧的脂肪族部分封盖疏水簇。在外侧，AaLS的R29残基通过阳离子-π相互作用与AaRS-CLS的W207结合。该R29残基也靠近AaRS的羧基末端，E122靠近CLS的K197，可能形成盐桥。然而，这些静电相互作用可能是动态的。cryo-EM密度无法确定这些氨基酸侧链带电部分的具体旋转异构体。
AaRS-CLS结合AaLS的结构基础与能量学 — 图2展示了AaRS-CLS结合AaLS的结构基础与能量学分析。丙氨酸扫描诱变实验（图2d）验证了关键残基的功能贡献：L121A和I125A突变几乎完全消除了CLS结合（p < 0.0001），R29A同样显著降低结合（p < 0.0001），而E122A和L26A突变影响较小。天然琼脂糖凝胶电泳pull-down实验（图2e）显示，GFP-CLS与AaLS野生型的结合效率设为100%时，L121A降至接近背景水平，I125A同样严重受损，R29A保留约40%结合。单因素方差分析（F(7, 24) = 54.54, p < 0.0001）及Dunnett事后检验确认了这些差异的统计学显著性。Rosetta能量计算（图2f–h）进一步支持了这些发现：W207、F201和I200在CLS与pre-C3界面结合中贡献最大的有利能量，而R29A和L121A突变导致ΔΔG Rosetta显著正值，表明这些突变破坏了结合稳定性。分子动力学模拟（图2i–j）揭示了R29与CLS C末端形成离子对相互作用的替代构象，表明该静电相互作用在动态平衡中与W207的阳离子-π接触共存。
构象门控与分子锁 — 图3揭示了LS笼组装最后阶段的关键构象变化。在空的11-五聚体AaLS中（图3a），跨越残基129–133的环采用"上"状态构象，遮蔽了W137。A128的主链羰基氧与R29的胍基形成氢键（青色虚线），将R29朝向CLS结合位点定向。当CLS结合pre-C3位点时（图3b），该环状态保持不变。然而，在完全组装的十二面体笼中（12个五聚体，图3c），最终五聚体的对接诱导环转变为"下"状态，暴露W137并将R29重新定向至E32形成静电锁（青色虚线），将R29从CLS结合构型中隔离出来。Rosetta局部自由能计算（图3d）显示，"下"状态的环在完整十二面体中能量上更稳定，而"上"状态在11-五聚体中间体中更受青睐。结合能计算（图3e、f）进一步表明，最终五聚体的插入在能量上比CLS结合更有利，当按实际结合次数（CLS为2×，最终五聚体插入为5×）缩放时，这种差异更加显著。
跨物种的系统发育分析与实验验证 — 对166种生物的RS C末端序列比对（图4a）显示，多种生物在RS C末端含有 bulky 疏水残基。AlphaFold结构预测（图4b）表明，来自Aquifex aeolicus、Bacillus subtilis和Thermotoga maritima的RS/LS同源物均能形成复合物，其中RS同源三聚体通过CLS肽段结合在LS五聚体界面的pre-C3区域。系统发育分布分析（图4c）显示，在166种分析生物中，复合物形成生物（绿色，+）分布于多个细菌门类，包括Actinomycetota、Bacillota、Cyanobacteriota、Aquificota和Pseudomonadota。实验验证（图4d、e）通过cryo-EM和SDS-PAGE确认了代表性生物的RS/LS复合物形成。生活方式相关性分析（图4f）揭示，复合物形成与核黄素需求及环境可用性之间存在关联：在核黄素需求高且环境可用性低的生物中，复合物形成比例最高。
层级组装机制模型 — 图5提出了控制RS/LS复合物化学计量的层级组装机制。左侧（橙色）展示了多价性促进的异源组装：RS三聚体展示三个CLS肽段，早期LS笼呈现多个pre-C3位点，多价结合在动力学上有利于RS三聚体结合的中间体。中下（蓝色）展示了空间约束：RS催化结构域的卷曲螺旋排列在物理上阻止了超过三个RS单体的容纳，防止过载。右侧（紫色）展示了构象门控与分子锁：LS环的开放构象和CLS锚定维持瞬时开放的中间体，防止过早闭合；最终五聚体对接时，LS环闭合伴随CLS释放，R29-E32分子锁稳定闭合复合物，防止解离。
讨论与解读
Cryo-EM结构揭示了一套控制AaRS/AaLS包含物复合体化学计量的层级机制（图5）。在组装早期，AaRS寡聚体通过卷曲螺旋结构域展示多个CLS肽段，而新生AaLS笼呈现多个pre-C3结合位点，多价相互作用在动力学上有利于异源复合物的形成而非空笼组装。同时，CLS锚定与五聚体界面构象门控相结合，使笼维持瞬时开放状态，为完整货物加载提供充足时间，防止导致欠载组装体的过早闭合。相反，卷曲螺旋引导的腔内催化结构域空间排列通过物理阻断每个笼容纳超过三个AaRS单体，防止了过载问题。十二面体完成后，热力学偏好和R29-E32分子锁防止五聚体释放，确保底物通道化和催化增强所需的持续封装。这些层级化机制为3:1的客体-笼化学计量比如何实现提供了分子层面的证据。
编译者解读 — 这项研究的核心价值在于揭示了一种全新的酶封装策略：货物识别不是靶向笼内表面，而是靶向组装中间体的界面位点。多价锚定、构象门控和分子锁的三重机制为合成生物学设计人工催化区室提供了可借鉴的"装配说明书"。尤其值得关注的是，研究团队通过结构引导的系统发育分析，证明了这种封装策略在自然界中多次独立演化——这意味着该模块化设计具有高度的可移植性和工程适应性。未来若能将CLS肽段与人工支架蛋白结合，或可实现对任意酶复合物的可编程化学计量封装，为多酶级联催化系统的构建开辟新途径。本研究的冷冻电镜密度虽已清晰解析了CLS锚定机制，但催化结构域在腔内的动态构象仍待进一步表征。
参考来源
Koziej L, Pankowski J, Stefanska M, Jankowski D, Gawin A. A molecular basis for stoichiometric enzyme encapsulation in the vitamin B2 biosynthesis compartment. Nat Commun. PMID: 42143052.
PMID: 42143052