酵母双通道光遗传学：多路光控细胞过程与代谢途径

📅 2026-08-11 📰 Nat Commun 2026 May 22 📂 研究进展 👁 22

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

导读

光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理、生物材料和代谢工程研究中展现价值。然而，酿酒酵母中不同波长光遗传系统因基因数量多、颜色间交叉激活等问题一直未能实现多路复用。本研究开发了仅需单基因、无需外源辅因子的红光响应光遗传系统y-iLight，并与EL222蓝光系统整合，首次在酿酒酵母中建立双通道光遗传学，实现木犀草素合成与絮凝的光控生产，并展示了多色活体材料的制备潜力。

研究背景

光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比传统化学调控方法，光控具有避免有害化学物质、与生物系统正交、可通过引入和撤除光照实现动态控制以及空间分辨率等优势。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光多种波长的光遗传系统被开发，利用不同颜色光对细胞内不同功能进行独立正交控制的潜力日益凸显。

尽管多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑的正交光遗传系统及颜色间交叉激活问题，酿酒酵母中仅实现了应用单一波长的单通道光遗传学。酿酒酵母作为模式生物，遗传学和生物学背景清晰，已被广泛用于生产高价值化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品和临床治疗等多种合成生物学应用。开发适用于酿酒酵母的多色光遗传系统，将拓展其在动态正交控制多个细胞过程方面的应用能力。

研究方法

双通道光遗传学在生物材料图案化中的应用

本研究涉及的双通道光遗传学最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光图案在特定位置激活细胞中基因表达的能力，已广泛应用于生物材料、神经科学和微生物群落互作研究。展示光遗传学空间特性的常用方法是将图像投射到带有荧光或彩色基因产物的细胞菌苔上，从而将图像“印刷”到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传学实现过单色图像。

为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX菌株构建了OY-γ.RB（红-蓝）菌株。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5‘-二溴-4,4’-二氯靛蓝）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。

▲ 将细胞悬浮液在水中的一层蒸发沉积在YNB琼脂上。平板通过掩膜暴露于5%红光24小时，再通过掩膜暴露于100%蓝光24小时。a OY-γ.RB（红-蓝）的遗传电路。b 压印出字母“I SEE YOU”。c NUS iGEM 2021标志PRYSM的压印。d 电影《小行星城》（韦斯·安德森导演，2023）中角色Augie Steenback一帧画面的压印。

OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投射到表面（补充图16）。图案被裁剪到黑纸上作为滤光片，先用红光照射选定区域24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，不需要NIR光来消除交叉激活（补充图17）。利用这种方法，研究团队成功印制了从字母到标志和精细图像的多种多色图案，展示了该系统的高空间分辨率和开发复杂活体材料的潜力。

研究结果

在酿酒酵母中开发单组分红光通道

多种红光响应转录因子已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发。然而，它们的缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子，或需要额外基因在体内内源合成辅因子。考虑到双通道系统中过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子用于酿酒酵母。虽然据其所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏感的IsPadC BphP蛋白获得。该蛋白由DNA结合域与IsPadC BphP的进化光感核心模块（PCM）融合而成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域的二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变使DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（NIR，770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它利用内源产生的胆绿素IXa。因此，研究团队推断它在酿酒酵母中同样有效——酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。

▲ a 双通道光遗传学将能够对生物生产中所用生物体的代谢通量进行多功能控制，并可用于更复杂的工艺与优化。b 光遗传学在活体材料工程中具有潜在应用，借助两个光通道，可控制活体材料上多个基因的局部表达。c 描述我们y-iLight红光通道的机制。d 描述EL222蓝光通道的机制。

细菌中展示的iLight版本不能直接适配到酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不理想，因为它利用了酿酒酵母Gal4 DNA结合域，与酿酒酵母生物学不正交。为工程改造适合酿酒酵母的系统，研究团队将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白。LexA常用于酿酒酵母正交合成转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA结构域，研究团队推断该蛋白构象在野生型LexA下应具有类似功能。由于原始SV40 NLS已融合在Gal4结构域的N端，SV40 NLS被重新附加到C端，产生了一个命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。Y-iLight被克隆到组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组YORWd17位点。同源启动子改编自Stelling等人的设计，由8个串联lexO重复序列阵列组成，位于CYC1核心启动子（cPCYC1）上游。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，又克隆了两个质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，并克隆到低拷贝附加体质粒上的mCitrine荧光报告基因上游，转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。

▲ a 适用于酿酒酵母的iLight蛋白基因回路，作为红光光遗传学系统。b 通过y-iLight与位于多种核心启动子上游的lexO阵列配对，表达mCitrine荧光报告子，并与组成型P ACT1 进行比较。BY474R细胞在30 °C摇床培养箱中培养，同时暴露于0–100%红光（光照强度操作值见补充图19），以及30分钟100%红光与30分钟暗处理交替循环（以三角形数据点表示）。荧光在24 h时测量并归一化至OD。

所有3个转化体在光遗传学光箱（Optobox，设备规格见补充注释15）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养。ACT1启动子（PACT1）在工业和研究应用中都是酿酒酵母常用的特征化启动子。为衡量工程启动子是否能驱动足够水平的基因表达以用于实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，用y-iLight启动子被组成型PACT1替换并位于mCitrine报告基因上游的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与保持在黑暗中的细胞相比，所有三个y-iLight响应质粒在暴露于各种光照强度的红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中工作，无需任何额外辅因子。

不同的核心启动子导致不同水平的报告基因表达。值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600未显示任何生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为出现在所有三个核心启动子中，很可能是y-iLight转录因子本身的特性。红光启动子非线性行为的一种可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为转录激活子在核心启动子附近结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是“促进扩散”，即由于转录因子在DNA链上拥挤，虽然初始结合速率增加，但转录因子停留时间减少，导致启动子表达不佳。这两种机制都会表现为高浓度活性转录因子存在时启动子表达降低。三个启动子可能对光有不同的敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及聚合酶在转录起始过程中解旋DNA的区域。

双通道光遗传学在类黄酮木犀草素合成中的应用

研究团队将红蓝双通道光遗传系统应用于类黄酮木犀草素的合成调控。木犀草素由柚皮素经菱形途径酶促转化而来（图5a）。构建了OY-γ.LutB/R(D)菌株，其中蓝光通道驱动F3’H表达，红光通道驱动FNSI表达（图5b）。在120分钟周期的不同红蓝光循环条件下培养该菌株，第一个数字表示暴露于蓝光加NIR光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。24小时后提取类黄酮并用HPLC表征（图5c）。

▲ a Enzymatic conversion of naringenin to luteolin through a diamond shaped pathway. b Genetic circuit for OY- γ.LutB/R(D). c Flavonoid production of OY- γ.LutB/R(D) in varying cycles of red and blue plus NIR(Near Infrard) light. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator in cycles with a per

RT-qPCR结果显示，F3’H表达（图5d）和FNSI表达（图5e）在不同光循环条件下相对于UBC6管家基因的ΔCt值与黑暗条件相比存在差异。在12小时25%蓝光加50% NIR光随后12小时25%红光的循环条件下（图5f），以及12小时25%红光随后12小时25%蓝光加50% NIR光的循环条件下（图5g），每6小时提取并表征类黄酮，揭示了不同光循环顺序对木犀草素产量的时序影响。

研究团队还建立了数学模型来模拟不同光循环条件下的类黄酮浓度（图6a），模型阐明了从柚皮素产生木犀草素的两条途径的调控机制和反应动力学（图6b）。模型预测了120分钟周期下不同占空比的蓝光加NIR光随后红光照射24小时的类黄酮水平（图6c），以及12小时光照循环下的时间响应曲线（图6d）。将模型预测与实验数据比较计算了决定系数R²值（图6e）。

▲ a Simulated flavonoid concentrations when exposed to one cycle varying proportions of blue plus NIR(Near-Infrared) light followed by red light illumination ( n = 1). b A schematic diagram of the model elucidating the regulatory mechanisms and reaction kinetics of the two pathways for producing luteo

生长-生产-提取三相生物制造

为简化产品提取流程，研究团队构建了OY-γ.LutFlo菌株，将絮凝功能纳入双通道光遗传系统（图7a、7b）。在不同光照条件下培养了OY-γ.LutFlo，包括黑暗48小时、50% NIR光48小时，或24小时25%蓝光加50% NIR光随后24小时25%红光，并在各时间点测量上清液的OD600（图7c、7d）。结果显示，在蓝光加NIR光条件下培养24小时后转入红光条件，OY-γ.LutFlo发生絮凝，上清液OD600显著下降，而OY-γ.LutB(D)对照菌株未显示絮凝现象。

▲ a Workflow of growth-production-extraction three-phase biomanufacturing. b Genetic circuit of OY- γ.LutFlo. c Photographs of flocculation of OY- γ.LutFlo in various light conditions. Cultures were kept in either darkness for 48 h, 50% NIR(Near-Infrared) light for 48 h, or 24 h of 25% blue plus 50% N

在木犀草素生产表征中（图7e），OY-γ.LutB(D)在25%蓝光加50% NIR光下培养30小时，在24小时和30小时时间点测量类黄酮浓度。OY-γ.LutFlo在25%蓝光加50% NIR光下培养24小时，随后在25%红光下培养6小时。24小时时从细胞培养物中提取类黄酮，30小时时从上清液（上层组分）或含絮凝物的剩余培养物（下层组分）中提取类黄酮。统计比较的p值如下：(i)−0.00421，(ii)−0.777，(iii)−0.00562，(iv)−0.00378，(v)−0.000331。

讨论与解读

本研究成功为酿酒酵母重构了仅需单一转录因子、不依赖任何外源添加辅因子的红光响应光遗传系统，解决了酿酒酵母缺乏紧凑单组分红光光遗传系统的问题，使多路光遗传应用成为可能。相比之下，最近开发的酿酒酵母红光响应转录因子PhiReX需要表达四个不同基因，包括酿酒酵母非内源辅因子的生物合成基因。PhiReX 1.1可实现高达41倍诱导，水平接近天然启动子PADH1；PhiReX 1.0可实现约PADH1强度的2倍，但仅11倍诱导。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然启动子PACT1相当。因此，y-iLight系统的动态范围介于PhiRex 1.0和1.1之间，同时与常用天然启动子水平相当。

一个阻碍双通道光遗传活性的意外交互是蓝光与红光通道之间的交叉激活。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在其基态吸收可见光谱红光范围的光，这一特性导致了蓝光对红光通道的交叉激活。通过工程改造模块化蛋白结构域——包括光诱导核输出序列和光敏降解子——研究团队成功减少了蓝光对y-iLight的交叉激活，同时保持了红光响应能力。

编译者解读

本研究的关键价值在于以最小基因负载（单基因、无外源辅因子）实现了红光光遗传模块，并理性设计模块化蛋白结构域来压制蓝光交叉激活，为真核多色光控提供了可复用的工程范式。将双通道光控与絮凝耦合实现“生长-生产-提取”三相生物制造，直击工业下游工艺痛点，体现了光遗传从实验室工具向生产平台迈进的务实思路。木犀草素合成的动态调控模拟与实验验证相结合，展示了定量模型指导光控策略设计的可行性。局限在于当前系统仍需进一步优化动态范围和正交性，且多层光控在放大培养中的光穿透问题有待解决，但这些并不妨碍该工作作为酵母多路光遗传里程碑式进展的地位。

参考来源

Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nat Commun. PMID: 42173879.

PMID: 42173879

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