来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
苯丙氨酸衍生物是基因密码子扩展技术最常用的非标准氨基酸家族，但传统做法依赖向培养基中直接添加这些昂贵试剂。2025年发表在《自然·通讯》上的一项工作，把“化学合成”和“位点特异嵌入”两件事塞进了同一株工程菌里。这株菌能以廉价的芳基醛或羧酸为原料，在胞内完成非标准氨基酸的半合成，再通过正交翻译系统将其直接装入目标蛋白。
研究背景
基因密码子扩展（GCE）技术让科学家能在活细胞中给蛋白质装上非天然氨基酸，用于生物正交反应、光交联、荧光标记等场景。然而这项技术有个绕不开的痛点：非标准氨基酸（nsAAs）必须以外源补料的形式添加到培养基里。这些化合物往往价格不菲，有些甚至没有商业供应，需要实验室自行合成纯化。对于缺乏化学合成经验的生物学实验室来说，这堵墙尤其高。
有没有可能让细胞自己造出这些非标准氨基酸？理论上，一条由转醛醇酶（TTA）、磷酸化脱氢酶（PSDH）和氨基转移酶（AT）组成的三酶级联，就能从芳基醛或羧酸出发合成苯丙氨酸衍生物。但问题是，这条合成路径与后续的蛋白嵌入步骤能否在同一株菌里兼容共存？本研究的作者们决定正面回答这个问题。
研究方法
菌株与质粒构建。 研究使用大肠杆菌作为底盘生物，分子克隆和载体扩增在DH5α菌株中完成。PCR扩增采用KOD XTREME Hot Start Polymerase，克隆组装使用Gibson Assembly法。用于翻译敲除的寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。报告蛋白和氨酰-tRNA合成酶（aaRS）变体的序列列于补充数据中。
关键化学试剂来源。 研究涉及的底物和产物来源多样：MilliporeSigma供应卡那霉素、氯霉素、链霉素、DMSO、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、二水氯化钙、甘油、Tris碱、甘氨酸、HEPES、ATP等；TCI America提供D-葡萄糖、苯丙酮酸、联苯-4-甲醛（4b）、对苯二甲醛（8e）、O-甲基-L-酪氨酸（7e）、2-萘甲酸（5a）、3-三氟甲基苯甲酸（12a）；Peptech供应4-乙酰-L-苯丙氨酸（2e）、4-氰基-L-苯丙氨酸（3e）、4-溴-L-苯丙氨酸（6e）、4-氟-L-苯丙氨酸（11e）、3-（2-萘基）-L-丙氨酸（5e）、4-苯甲酰-L-苯丙氨酸（10e）；Thermo Scientific Chemicals提供4-苯甲酰苯甲酸（10a）、4-氟苯甲酸（11a）、4-溴苯甲醛（6b）、4-溴苯甲酸（6a）、4-氟苯甲醛（11b）；Sigma-Aldrich提供苯甲醛、联苯-4-羧酸（4a）、4-甲酰苯甲酸（8a）、L-苯丙氨酸等。
生物合成通路原型验证。 为了在活细胞中验证生物合成通路，研究者选取了四种模型底物，分别对应四种广泛使用的非标准氨基酸：4-叠氮基苯甲醛（1b）用于合成4-叠氮基-L-苯丙氨酸（1e）；4-乙酰基苯甲醛（2b）用于合成4-乙酰基-L-苯丙氨酸（2e）；4-氰基苯甲醛（3b）用于合成4-氰基-L-苯丙氨酸（3e）；4,4-联苯甲醛（4b）用于合成4,4-联苯-L-苯丙氨酸（4e）。这四种底物在结构和电子特性上具有多样性，能够初步揭示活细胞环境中的底物耐受性。
研究者此前设计的一锅法生物催化级联表明，来自荧光假单胞菌的SUMO标签化TTA变体（s-ObiH）能够接受这四种模型醛底物。在本研究中，工程菌株被设计为共表达SUMO标签化的TTA（s-ObiH或s-PbTTA）和s-RpPSDH，依赖内源氨基转移酶的本底表达水平完成从醛前体到目标非标准氨基酸的转化，同时需要补充L-苏氨酸作为氨基供体。
正交翻译系统兼容性测试。 研究者将上述生物合成模块与基于荧光报告蛋白的常见正交翻译系统（OTSs）组合，观察非标准氨基酸的“合成+嵌入”能否在同一细胞内协同工作。原文摘要未详述荧光报告蛋白的具体类型和检测波长，但指出该方法可对12种不同非标准氨基酸进行生物合成验证。
研究结果
活细胞中模型β-羟基化非标准氨基酸的生物合成。 研究者首先验证了四种模型底物在活细胞中的转化效率。通过向培养基中补充相应的芳基醛前体和L-苏氨酸，工程菌株成功合成了四种目标非标准氨基酸：4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-乙酰-L-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸和4,4-联苯-L-苯丙氨酸。原文摘要未提供各产物的具体胞内浓度数值，但明确表示“观察到这些化学品的联合生物合成和嵌入”。
底物谱广度。 平台通路对商业上普遍存在、非手性的芳基醛或羧酸类模块表现出广泛的底物特异性。研究者演示了12种不同非标准氨基酸的生物合成，涵盖了GCE应用中最常使用的苯丙氨酸衍生物家族。这12种产物包括但不限于：4-乙酰基-L-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、4-氟-L-苯丙氨酸、3-（2-萘基）-L-丙氨酸、4-苯甲酰-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸等。
合成与嵌入的耦合。 基于荧光报告分析，研究者证实了这些化学品的生物合成与位点特异嵌入可以在同一细胞中协同完成。换言之，细胞从廉价的芳基醛或羧酸出发，经过胞内多酶级联生成非标准氨基酸，随后正交翻译系统直接将这些氨基酸装入目标蛋白——全程无需外源添加任何非标准氨基酸。
合成营养缺陷型的化学延伸。 更值得注意的是，研究者将非标准氨基酸生物合成与GCE步骤结合，把合成营养缺陷型这一内源生物遏制策略的化学依赖从非标准氨基酸扩展到了低成本的非手性模块。这意味着，原本依赖特定非标准氨基酸才能存活的工程菌，现在可以改喂廉价的芳基醛或羧酸，同样实现生长控制。
讨论与展望
这项工作的核心价值在于“去依赖”。传统GCE实验离不开外源非标准氨基酸补料，而本平台让细胞自己完成从廉价前体到最终蛋白产物的全链条。对工业界而言，这意味着含非标准氨基酸的蛋白大规模制造可能不再受制于昂贵原料；对学术界而言，缺乏分离纯化或传统合成经验的实验室，也能触及那些昂贵或商业上无法获得的化学空间。
一个值得注意的设计选择是使用SUMO标签化的TTA变体（s-ObiH或s-PbTTA），而非天然酶。这可能是为了提升可溶性表达或底物耐受性——但原文摘要未详述具体改造策略，此处不作过度解读。另一个亮点是合成营养缺陷型的“降级”改造：从依赖昂贵的非标准氨基酸，转变为依赖几块钱一克的芳基醛。这种从源头降低成本的思路，对生物遏制技术的规模化应用具有直接的现实意义。
当然，这株工程菌的性能还有优化空间。12种非标准氨基酸的合成是否都能达到足以支撑高效蛋白嵌入的胞内浓度？不同底物的转化效率差异如何？这些具体数据原文摘要尚未披露，有待全文数据的进一步公开。但无论如何，这一“单菌株整合”策略已经为活细胞内的非标准氨基酸生产与利用勾勒出一条清晰的技术路径。
参考来源： Anderson SR, Spangler AP, Forti AM, Jones MA, Dickey RM. Combined biosynthesis and site-specific incorporation of phenylalanine derivatives from aryl aldehydes or carboxylic acids. Nature Communications, 2025. PMID: 42177189.
PMID: 42177189