来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
乳酸菌的基因编辑向来是块硬骨头。厚实的肽聚糖细胞壁、低下的转化效率、菌株特异的限制修饰系统——每一道都是拦路虎。更棘手的是，Cas9蛋白引发的双链断裂对这些细菌往往致命。德国研究人员最近在《Journal of Biological Engineering》上发表了一项研究，他们通过系统优化转化条件和编辑流程，成功在植物乳杆菌8P-A3中实现了plnD基因的定向敲除，并由此激活了细菌素的过量生产。这项成果为乳酸菌的代谢工程改造提供了一条务实路径。
研究背景
乳酸菌在食品发酵、益生菌制剂和抗菌肽生产中扮演着重要角色。植物乳杆菌合成的细菌素——特别是plantaricin家族——具有广谱抗菌活性，在食品防腐和替代抗生素领域前景广阔。然而，这类细菌的遗传操作长期受制于几个固有障碍：细胞壁中厚重的肽聚糖层阻碍外源DNA进入；不同菌株间的限制修饰系统会降解异源DNA；而Cas9诱导的DNA双链断裂对乳酸菌而言往往意味着细胞死亡而非基因修复。
植物乳杆菌8P-A3菌株的细菌素合成受群体感应系统调控。plnD基因编码这一调控网络中的关键负调控因子，相当于整个系统的“刹车”。如果能精准拆除这个刹车，细菌素合成通路就可能被持续激活。但问题在于——如何把CRISPR/Cas9系统高效送进这堵“墙”里，并成功完成编辑？
德国亚琛工业大学的团队给出的答案是：双质粒系统加全流程参数优化。
研究方法
菌株与培养条件
研究使用的植物乳杆菌8P-A3菌株由俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所的Alexander Suvorov博士提供，最初分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum。菌株在MRS培养基（pH 5.7，Carl Roth公司，货号HP64.1）中培养。需要添加抗生素时，培养条件为37°C、150 rpm振荡培养12-16小时，全程保持厌氧环境——厌氧条件通过BD GasPak™ EZ产气袋系统配合指示剂（货号260683，BD公司）实现。固体培养基使用MRS琼脂（Carl Roth公司，货号HP65.1）。
电转化感受态细胞制备
这是整个流程中最考验细节的环节。研究团队制备了两种关键溶液：MRS-G（MRS-甘氨酸）溶液和蔗糖-甘油（SacGly）溶液。
2.5% MRS-G溶液的配制方法为：向25 mL MRS肉汤中加入0.625 g甘氨酸，然后用0.22 μm滤膜过滤除菌。甘氨酸的作用在于削弱肽聚糖层的交联密度——它竞争性替代细胞壁中的丙氨酸残基，使细胞壁结构松散，为后续电穿孔打开通道。
SacGly溶液的配制：将85.55 g蔗糖溶解于400 mL水中，再加入100 mL 50%甘油。高渗蔗糖环境帮助细胞在电击后维持渗透压稳定，甘油则作为冷冻保护剂。
电穿孔条件
电穿孔使用Bio-Rad MicroPulser Electroporator（目录号1652100）和0.1 cm间隙的Gene Pulser/MicroPulser电转杯（目录号1652093）。电击后，细胞在MMRS（改良MRS）培养基中恢复——该培养基在MRS肉汤基础上添加了500 mM蔗糖、20 mM MgCl₂和2 mM CaCl₂。高渗蔗糖促进细胞壁再生，二价阳离子则辅助细胞膜修复。
原文摘要未详述电穿孔的具体电压、电阻和电容参数，也未提供电击后恢复培养的具体时长。
CRISPR/Cas9双质粒系统设计
研究采用双质粒SpCas9系统实现plnD基因的定向敲除。两个质粒分工明确：
CR质粒（pCB578）负责表达SpCas9核酸酶、tracrRNA以及一个重复-间隔-重复（repeat-spacer-repeat）序列元件。这个间隔序列携带靶向plnD基因的20 nt引导序列。
RT质粒（pCB591）则携带plnD基因内部的删除/突变序列，作为同源重组修复（HDR）的模板。当Cas9在靶位点切断DNA后，细胞会以RT质粒上的序列为模板进行修复，从而将预先设计的内部缺失引入plnD基因。
两个质粒的正确组装通过菌落PCR（cPCR）、限制性酶切消化和Sanger测序三重验证确认。验证无误后，两个质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3，最终获得CRM（CRISPR-modified）菌株。
研究结果
编辑事件的分子验证
CRM菌株在无抗生素培养基中连续传代后，研究人员筛选并分离了丢失红霉素和氯霉素抗性的菌落——抗生素敏感表型表明两个质粒均已被成功清除。这步操作至关重要：质粒残留意味着编辑事件可能不稳定，而质粒清除后的表型变化才能真实反映基因组编辑的效果。
PCR扩增完整的plnA-plnD基因座，使用侧翼引物进行扩增，CRM菌株的扩增产物明显短于野生型（WT）菌株的扩增产物——这一大小差异与plnD基因内部发生缺失的预期一致（图5B）。
靶向扩增子测序提供了核苷酸级别的编辑确认。研究团队使用Geneious Prime、Benchling、SnapGene等多个独立平台进行高严格度比对分析，所有平台均显示出一致的HDR介导的缺失连接位点，同时在plnD基因区域内伴随少量碱基突变（图5A）。关键的是，CRM等位基因完全缺失了完整的20 nt间隔序列识别位点及其相邻的5'-NGG PAM基序。
这意味着什么？Cas9蛋白的切割依赖于间隔序列识别和PAM基序确认双重条件。编辑后的等位基因同时失去了这两个关键元件，Cas9将无法再识别和切割该位点——这从根本上杜绝了Cas9对已编辑基因座的二次切割，确保编辑结果稳定遗传。
细菌素合成通路的激活
plnD是plantaricin群体感应网络中的负调控因子。敲除该基因后，调控网络的抑制被解除。基因表达分析显示，CRM菌株中plnA、plnE和plnF基因的表达水平均出现上调。这三个基因分别对应plantaricin生物合成通路中的关键结构基因和辅助基因——plnA编码诱导肽前体，plnE和plnF则参与细菌素的结构合成。
表达上调的直接结果是抗菌活性的提升。研究团队检测了CRM菌株的抗菌活性，结果显示其抑菌能力显著高于野生型菌株。原文摘要未提供抑菌圈直径的具体数值或最小抑菌浓度的定量数据。
![Quorum sensing–regulated plantaricin system in L. plantarum 8P-A3 strain (Figure adapted and modified from Goel, A. et al., 2023 [ 23 ] and Tsapieva, A. et al., 2011 [ 24 ]). Schematic representation of the plnABCD regulatory network. Extracellular PlnA activates the histidine kinase PlnB, which pho](/d/file/research/202608/art_81_1786439863_0.webp)
图1：双质粒CRISPR/Cas9系统构建与plnD基因敲除流程示意图
图2：CRM菌株与野生型菌株的plnA-plnD基因座PCR扩增对比（图5B）
图3：靶向扩增子测序确认plnD基因内部缺失及PAM基序丢失（图5A）
讨论与展望
这项研究的价值不在于原理创新——CRISPR/Cas9用于乳酸菌编辑已有先例——而在于系统性的工程优化。研究团队把每个环节都当作变量来处理：感受态制备时甘氨酸的浓度、电击后恢复培养基的渗透压和离子组成、质粒清除的传代策略、编辑后等位基因的稳定性验证。每一步都针对乳酸菌的固有障碍给出具体对策。
plnD敲除策略的设计也颇具巧思。选择负调控因子而非直接过表达结构基因，相当于松开刹车而不是猛踩油门。这种间接激活方式更贴近细胞自然的调控逻辑，可能有助于避免代谢负担过重导致的生长抑制。
当然，这项研究仍有未回答的问题。原文摘要未提供细菌素产量的具体定量数据，也未详述编辑效率（即成功编辑菌落占总菌落的比例）。抗菌活性的提升幅度、对哪些指示菌株有效、编辑后菌株的生长动力学变化——这些细节都有待进一步研究。
从应用角度看，plnD敲除菌株在食品防腐和益生菌领域具有明确潜力。细菌素作为天然抗菌肽，在“替抗”大背景下价值凸显。本研究提供的双质粒系统框架，理论上也可移植到其他乳酸菌菌株——只需更换间隔序列和同源臂即可。当然，不同菌株的转化效率和限制修饰系统差异，意味着这套流程可能需要针对性地重新优化。
乳酸菌基因编辑的“最后一公里”——从实验室验证到工业化应用——依然漫长。但至少，这条路已经被踩实了一段。
PMID: 42527938