来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其生物转化面临低pH、高温及发酵抑制物等多重胁迫。本研究以具有卓越多重胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现模式酵母酿酒酵母的展示组件在该菌中失效，进而基于内源 IoSED1 基因构建了适用于该菌的细胞表面展示系统，成功展示增强型绿色荧光蛋白（eGFP）与β-葡萄糖苷酶（BGL），所得菌株可在纤维二糖为唯一碳源且含抑制物的条件下稳健生长。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了可持续生物制造体系的开发。木质纤维素生物质（LCB）因储量丰富且不与粮争地，成为最具潜力的替代原料。LCB中纤维素和半纤维素分别约占生物质总量的40–50%和20–40%，可经化学与酶处理水解为可发酵单糖，再经工程微生物转化为生物基化学品与燃料。酵母因抗噬菌体感染、遗传操作便利及异源蛋白表达能力高等优势而成为理想宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素与半纤维素的能力，且LCB的酸性热化学预处理会形成低pH、高温及含发酵抑制物的严苛培养环境，要求展示纤维素酶的宿主菌具备突出的胁迫耐受性。东方伊萨酵母恰好具备这一特性。
研究方法
菌株与培养基
Escherichia coli NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）作为重组DNA操作宿主。E. coli 转化子在添加100 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）中于37 °C培养。本研究所用11株 I. orientalis 野生型菌株购自NITE生物资源中心（NBRC，日本东京），酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母培养基为YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto-蛋白胨［Difco Laboratories，美国密歇根州］、20 g/L葡萄糖）、缺少尿嘧啶的SC dropout培养基（SC-URA）（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱［Difco Laboratories］、1.92 g/L无尿嘧啶酵母合成 dropout 补充物［Sigma-Aldrich，美国密苏里州］、20 g/L葡萄糖）或SD培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱［Difco Laboratories］、20 g/L葡萄糖）。
东方伊萨酵母NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将 I. orientalis 与酿酒酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl和0.5 M KOH调至2或6。使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，日本东京）在L形管中于30 °C或45 °C、40 rpm培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香草醛）的耐受性，将细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600为1、0.1、0.01或0.001），各取3 µL点样于添加了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香草醛10 mM）的SD琼脂平板，于30 °C培养96–120 h，用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，日本东京）记录菌落生长。
东方伊萨酵母NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，日本大阪）提取 I. orientalis NBRC1664基因组DNA。分别用引物对URA3-UP-F/URA3-UP-R和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R通过聚合酶链式反应（PCR）扩增 I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂（Xiao等，2014）。通过重叠延伸PCR融合这些片段，将所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在添加1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。用引物对Colony-P-F/Colony-P-R通过菌落PCR确认IoURA3 ORF的缺失。为验证尿嘧啶营养缺陷，将转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线并于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，日本滋贺）按制造商说明书构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
用引物对URA3-F/Colony-P-R通过PCR从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IoURA3基因片段，导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到pVT。用引物对ScSED1p-F/ScSAG1t-R从质粒pleGFP-SSS（Inokuma等，2020）中扩增含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达盒的片段，导入pVT的SacI位点，得到质粒pVT-SceGFP。
从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA用引物对IoSED1a-F1/IoSED1a-R1扩增去除分泌信号后的IoSED1编码区（表S4）。该片段与以plBG-SSS（Inokuma等，2016）为模板、用引物对Vector-F/Vector-R经PCR扩增的片段融合，所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定域被替换为IoSED1锚定域。构建含IoSED1启动子、分泌信号和锚定域的eGFP展示质粒的流程如下：从 I. orientalis NBRC10737基因组DNA用引物对IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R1扩增含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段；用引物对eGFP-F/eGFP-R从pleGFP-SSS扩增eGFP编码区片段；用引物对IoSED1a-F2/IoSED1a-R2从plBG-SSIoS扩增编码IoSED1锚定域的片段。将这三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
构建可整合至 I. orientalis NBRC1664染色体2已知基因间位点IS2（Lee等，2022）的整合型质粒的流程如下：分别用引物对IS2-UP-F/IS2-UP-R和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R从 I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段。在IS2-UP-R的重叠区插入PacI识别位点。通过重叠延伸PCR融合这两个片段，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。将该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。用引物对IoSED1p-F/ScSAG1t-R从pVT-IoeGFP扩增eGFP展示基因表达盒，导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
构建展示 A. aculeatus BGL1的整合型质粒的流程如下：分别用引物对IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2从pVT-IoeGFP扩增IoSED1启动子和分泌信号片段及IoSED1锚定域片段。用引物对BGL-F/BGL-R从plBG-SSS经PCR扩增编码 A. aculeatus BGL1的DNA片段。将这三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的 I. orientalis 菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT以同样方式导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。为实现eGFP展示盒的基因组整合，将整合型质粒pVT-IS-IoeGFP用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的 I. orientalis 菌株，将整合型质粒pVT-IS-IoBGL用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoBG-int菌株。
所有 I. orientalis 菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照Xiao等（2014）并作少量修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养。取等分试样接种至3 mL新鲜YPD培养基中，继续培养至适当浓度后收集细胞，依次用醋酸锂溶液和转化混合液处理，经热激后涂布于相应选择平板，于30 °C培养至单菌落出现。
研究结果
东方伊萨酵母NBRC1664的多重胁迫耐受性评估
为比较 I. orientalis 与模式酵母酿酒酵母的多重胁迫耐受性，本研究评估了从NBRC获得的11株 I. orientalis 中耐受性最强的NBRC1664菌株（图S1）与酿酒酵母BY4741在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，两种菌在pH 6条件下均生长良好，但 I. orientalis 的生长优于酿酒酵母。在pH 2条件下，I. orientalis 表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同，而酿酒酵母在pH 2下无法生长。类似地，在45 °C下 I. orientalis 成功生长而酿酒酵母不能生长；两种菌在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香草醛）存在下的生长情况，进行了点样实验（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的浓度范围内（Mills等，2009）。在添加适当营养物的SD培养基上、非胁迫条件下，两种菌均形成明显菌落。在暴露于发酵抑制物时，I. orientalis 在三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而酿酒酵母在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上，I. orientalis NBRC1664具备显著的多重胁迫耐受性。
展示eGFP的东方伊萨酵母菌株评估
为确定与GPI锚定域融合的蛋白质能否固定在 I. orientalis 细胞表面，构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达此前已证明可在酿酒酵母细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma等，2020），其由酿酒酵母SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定域及酿酒酵母SAG1终止子组成（图2a）。将携带该表达盒的附加型质粒pVT-SceGFP导入 I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株（一种尿嘧啶营养缺陷型菌株，其尿嘧啶营养缺陷已通过生长分析确认，图S2），并按“材料与方法”所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
随后推测荧光缺失源于异源遗传元件在该菌中功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定域对展示效率有决定性影响（Inokuma等，2014，2016；Zhang等，2013）。因此，构建了将各元件替换为IoSED1基因对应元件的改良展示盒（图2a）。IoSED1与ScSED1基因同源（Kitagawa等，2010），且根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber等，2004）推测编码GPI锚定蛋白。此外，IoSED1来源的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa等，2010）。将新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察到清晰的表面定位荧光（图2b）。该荧光模式与酿酒酵母eGFP展示菌株（Inokuma等，2020）中观察到的模式相当，表明eGFP成功展示于 I. orientalis 细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅有少数细胞呈现荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，将展示盒整合至基因组。按“材料与方法”所述构建了设计用于将表达盒插入 I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee等，2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，呈现清晰表面定位信号的细胞比例显著增大（图2b），这与流式细胞术结果（图S3）一致。综上，这些结果表明成功构建了可在 I. orientalis 细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的东方伊萨酵母菌株评估
随后，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，构建了展示 A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao等，1988）的 I. orientalis 菌株，命名为16-IoBG-int（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h后，在30 °C下分别评估细胞组分和培养上清中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示于 I. orientalis 细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1在LCB生物转化预期高温条件下的活性（Yanase等，2010），将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著升高至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与 A. aculeatus BGL1最适温度处于50 °C以上高温范围的事实一致（Murao等，1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的BGL展示菌株能否在胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源生长，将16-IoBG-int菌株接种于含1.9%纤维二糖和0.1 M MOPS（pH 6.5）的SC培养基中培养。结果显示，该菌株能够以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，同时培养基中残余纤维二糖浓度随时间逐渐降低。进一步在含25.4 mM 5-HMF或100 mM乙酸的同种培养基中培养时，16-IoBG-int菌株在两种抑制物存在下均维持了细胞生长和纤维二糖消耗能力。亲本菌株NBRC1664/ura3Δ在这些条件下均无法以纤维二糖为唯一碳源生长。
讨论与解读
本研究开发了适用于多重胁迫耐受酵母 I. orientalis 的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且能在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下同化纤维二糖。采用IoSED1基因来源的启动子、分泌信号和锚定域构建新基因表达盒后，eGFP展示获得成功。基因组整合展示盒与附加型质粒表达系统相比显著提高了细胞表面呈现eGFP荧光的细胞比例，表明附加型表达在 I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。即便在基因组整合菌株中，仍观察到部分非荧光细胞，且较小尺寸细胞的荧光较弱，这可能反映了细胞周期不同阶段或细胞生理状态对展示效率的影响。据作者所知，这是首篇证明 I. orientalis 细胞表面可成功固定功能蛋白，并可在胁迫条件下通过展示纤维素酶同化LCB衍生中间产物的报道。
编译者解读
该研究的关键价值在于揭示了不同酵母物种间细胞表面展示元件的物种特异性——酿酒酵母来源的启动子/分泌信号/锚定域在东方伊萨酵母中完全失效，而替换为内源IoSED1元件后即恢复功能。这一发现提示，在非模式酵母中开展表面展示工程时，宿主内源锚定蛋白的挖掘往往比直接借用模式菌株的成熟元件更为有效。从应用角度看，该策略将纤维素酶生产、糖化和发酵整合于单一步骤，为木质纤维素生物转化提供了一条简化路径。局限在于目前仅展示了单酶（BGL），且基因组整合菌株中仍存在部分细胞不展示蛋白的现象，未来若能将纤维素酶系（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）共展示于同一菌株，将更接近完整的纤维素直接转化目标。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235