来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
手性α-羟基酸是药物、精细化学品和可降解聚合物合成的关键砌块，其高效、高立体选择性制备长期受困于化学催化的严苛条件与环境代价。合成生物学的发展为多酶级联催化开辟了新路径，但天然酶在非天然底物、有机溶剂耐受性等方面的缺陷限制了其工业应用。近期，研究人员通过构建一套基于定向进化的多酶级联催化系统，成功实现了多种手性α-羟基酸的半合成，在温和条件下获得高达99%的对映体过量值及优异的产率。这项工作将理性设计与定向进化深度结合，不仅拓宽了生物催化的底物谱，更展示了多酶系统在绿色制造中的巨大潜力。
研究背景
手性α-羟基酸是一类在α位碳原子上同时连接羟基和羧基的手性分子，代表化合物包括L-乳酸、D-扁桃酸、L-苯乳酸以及多种α-羟基异己酸衍生物。其中，L-乳酸作为聚乳酸的单体，在生物可降解材料领域已实现百万吨级产业化；光学纯的扁桃酸及其衍生物则是半合成青霉素、头孢菌素以及抗肿瘤药物的重要中间体；苯乳酸更是被用作广谱抗菌剂和食品防腐剂。这类化合物的手性构型直接决定其生物活性和材料性能，因此发展高立体选择性的合成方法一直是绿色化学与制药工程的核心课题。
传统化学法合成手性α-羟基酸主要依赖不对称氰醇化、手性拆分或过渡金属催化氢化，往往面临反应步骤冗长、需要使用剧毒氰化物、昂贵的金属催化剂及手性配体，且产物光学纯度难以突破95% ee 的瓶颈。酶催化因具有严格的立体选择性、反应条件温和以及环境友好等特点，被视为理想的替代方案。然而，单酶催化往往只能完成一步转化，若能从简单前体出发，通过多种酶的串联实现“一锅法”多步反应，不仅可以省去中间体分离步骤，还能驱动热力学平衡向产物方向移动，显著提高原子经济性和生产效率。
近年来，多酶级联催化（Multi-Enzyme Cascade Catalysis）在合成生物学与代谢工程领域发展迅猛。以羟基腈裂解酶、酯酶、酮还原酶、氨基酸脱氨酶等为代表的工具酶库不断扩充，使得以醛、酮、氨基酸等大宗化学品为起始原料合成手性α-羟基酸成为可能。然而，天然酶在应对非天然底物时常常表现出催化效率低下、底物抑制或立体选择性翻转等问题，而多数工业应用场景中存在的有机溶剂、极端 pH 和高温条件也会使酶迅速失活。因此，如何精准改造酶分子，使其满足多酶级联中各步骤对底物专一性、辅因子循环相容性和环境耐受性的多重需求，成为该领域亟待攻克的关键瓶颈。
研究方法
该研究围绕“半合成”策略展开，即采用化学法提供关键的非天然底物前体，再通过定向进化改造的多酶级联体系完成高立体选择性转化。整体技术路线分为三个核心模块：酶元件的筛选与定向进化、多酶级联路径的构建与优化、以及半合成体系的过程放大与产物鉴定。
首先，研究者从BRENDA数据库和已报道的基因组挖掘数据中，筛选出具有潜在催化α-酮酸还原、羟基腈水解或氨基转氨功能的候选酶。针对手性α-羟基酸的两条主要合成路线——酮酸还原路线和氰醇水解路线，分别选择了来源于*Lactobacillus kefir* 的酮还原酶LkADH、来源于*Pseudomonas putida* 的扁桃酸消旋酶/脱氢酶、来源于*Hevea brasiliensis* 的羟基腈裂解酶HbHNL以及来源于*Cupriavidus necator* 的腈水解酶。这些酶在底物谱和立体选择性方面各具特色，但对芳香族α-酮酸或长链脂肪族底物的催化活力普遍偏低。
为突破天然酶的性能天花板，研究团队采用了组合型定向进化策略。首先通过易错PCR引入随机突变，构建含~10⁴个变体的初代文库。针对酮还原酶LkADH，设计了一种基于NADH荧光的高通量筛选方法：在辅因子循环体系（葡萄糖/葡萄糖脱氢酶）中将催化活性与荧光信号耦合，使得96孔板中阳性克隆的筛选效率大幅提升。对于底物耐受性，研究者还引入了有机溶剂共溶剂（10% DMSO或甲醇）作为筛选压力，以富集在工业相关条件下仍保持高活力的突变体。经过三轮易错PCR和两轮DNA重组，获得了关键突变体LkADH-M5（V86A/F127L/T190A），其对4-苯基-2-酮丁酸的比活力提高了15倍，且对映体选择性保持>99% ee (R)。
对于氰醇水解路线，HbHNL的改造则聚焦于底物结合口袋的重塑。以同源模建结构为基础，选择活性中心5 Å范围内的15个氨基酸位点进行饱和突变，构建了“小而精”的聚焦文库。通过一个基于苯甲醛释放的比色初筛和手性HPLC复筛，分离得到突变体HbHNL-W12，该变体对大体积芳香醛底物（如3-苯氧基苯甲醛）的转化数提高了一个数量级。随后，将改造后的酶元件组装成两条平行的多酶级联路线：路线A为“α-酮酸 + NADH + LkADH-M5 → 手性α-羟基酸”，利用葡萄糖脱氢酶原位再生NADH；路线B为“醛 + HCN → 氰醇（HbHNL-W12催化）→ 酸水解或腈水解酶作用 → 手性α-羟基酸”。
级联体系的过程优化在10–100 mL规模的反应器中进行。研究人员系统考察了酶载量比、辅因子浓度、pH、温度及氧传递速率对级联效率的影响。尤其亮点在于，为了规避氰醇水解路线中HCN的毒性和挥发问题，研究采用原位生成HCN的策略，即通过亚铁氰化钾与醛缓慢释放氰根离子，使体系内HCN浓度始终维持在低水平，既保障操作安全，又减弱底物抑制效应。最终，在路线A的优选条件下，可在6小时内将100 mM的4-苯基-2-酮丁酸完全转化为(R)-2-羟基-4-苯基丁酸，产物浓度达98 mM，分离产率92%。
研究结果
该定向进化多酶级联催化系统在底物广谱性、立体选择性和工艺稳定性等维度均展现出显著突破。
在底物广谱性评价中，LkADH-M5突变体对测试的12种α-酮酸均表现出高活力，涵盖脂肪族（α-酮丁酸、α-酮异己酸）、芳香族（苯丙酮酸、4-羟基苯丙酮酸）及杂环类底物。特别对传统化学法难以高对映选择性还原的大位阻底物4-苯基-2-酮丁酸和吲哚-3-丙酮酸，M5突变体分别给出了98% ee和>99% ee。氰醇路线中的HbHNL-W12也顺利将7种芳香醛转化为相应氰醇，随后的水解步骤由固定化的*Cupriavidus necator* 腈水解酶完成，整体产物ee值均>95%。两种路线互补，可覆盖超过20种手性α-羟基酸的合成。
核心数据表明，路线A在制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸（关键药物中间体）的放大实验中表现卓越。在500 mL反应体系内，底物装载量提升至200 mM，补料分批策略将NADH总周转数提升至~15,000，生产强度达到12.3 g·L⁻¹·h⁻¹。产物经萃取、脱色和重结晶后，化学纯度>99%，光学纯度维持99.2% ee。全细胞催化模式下的酶稳定性实验显示，连续5个批次后，固定化LkADH-M5和葡萄糖脱氢酶共固定化珠仍保留初始活力的85%，体现出良好的操作稳定性。
另一亮点在于半合成概念的落地。传统的全发酵法或全酶法从葡萄糖合成复杂手性α-羟基酸往往需要复杂的代谢途径调控，而“半合成”充分利用了化学合成灵活、快捷地制备非天然酮酸或醛中间体的优势，然后由定向进化的多酶级联完成最后的“点睛之笔”，兼顾了效率与选择性。这种杂合模式为那些天然代谢通路中不存在的“非天然”α-羟基酸的生产提供了通用平台。
研究还深入揭示了突变体性能提升的分子机制。LkADH-M5的三点突变V86A/F127L/T190A协同重塑了底物结合口袋：V86A扩大了小结合腔的体积，F127L削弱了苯丙氨酸侧链对大体积芳香底物的空间位阻，而T190A则移除了与底物羟基形成冗余氢键的苏氨酸，降低了过渡态活化能。分子动力学模拟表明，与非突变酶相比，M5突变体与4-苯基-2-酮丁酸结合时的回转半径更小、口袋内水分子排布更有序，底物反应位点至催化残基的距离由6.2 Å缩短至3.8 Å，完美解释了催化效率的提升。
讨论与展望
这项工作通过定向进化技术与多酶级联工程的深度耦合，为手性α-羟基酸的制造提供了一套绿色、高效、可定制的生物催化方案。其首要启示在于，半合成策略可充分发挥化学与生物的互补优势：化学步骤解决了非天然中间体的可获得性，而生物催化赋予产物极高的立体化学纯度，这种分工协作模式有望成为精细化学品生产的新范式。
从方法学层面看，研究构建的“聚焦文库+压力筛选”定向进化策略，针对性地解决了非天然底物耐受和有机溶剂耐受两大共性难题，对未来其它氧化还原酶、裂解酶的改造具有直接借鉴意义。同时，原位辅因子循环和安全氰源释放等过程强化手段，证明了酶反应工程的精密度同样是级联成功不可或缺的因素。
然而，现阶段该体系仍处于中试放大的初期，工业化应用尚需攻克若干挑战。例如，NADH辅因子的成本尽管通过循环显著降低，但在极大规模生产中仍是经济性敏感指标，未来可探索人工辅因子模拟物或电化学再生策略。此外，多酶体系在长时间连续操作中的动力学匹配和中间代谢物积累问题，需要借助数学模型和在线监控技术进一步优化。随无细胞合成生物学和计算辅助酶设计的快速发展，有理由相信，更加、模块化的多酶级联工厂将在不久的将来，驱动手性羟基酸乃至更广阔手性化合物领域的绿色制造变革。
**参考来源**
Yuxiang Li. Construction and Application of a Directed Evolution-Based Multi-Enzyme Cascade Catalytic System for Semi-Synthesis of Chiral α-Hydroxy Acids. *Semantic Scholar*, 2025. DOI: 10.54254/2755-2721/2025.24774
DOI: 10.54254/2755-2721/2025.24774