来源：ACS Synth Biol | 编译：DNA Lab Space
无细胞表达系统（CFES）正在从实验室工具走向现场检测与便携式生物制造。然而，它的普及被一个现实问题卡住——冷冻保存。液氮罐、超低温冰箱、干冰运输，这些苛刻条件让CFES的“便携”大打折扣。冻干技术曾被寄予厚望，但保护性添加剂往往以牺牲活性为代价。现在，德国研究者从水熊虫身上找到了一把钥匙：一种名为CAHS的胞质丰富热溶性蛋白，无需任何其他添加剂，就能在室温干燥条件下保护无细胞表达系统的蛋白质合成活性。这项工作发表在《ACS Synthetic Biology》上，论文通讯作者为Niederholtmeyer课题组。
研究背景
无细胞表达系统绕过细胞壁的束缚，直接利用胞内转录翻译机器合成目标蛋白。它在代谢途径原型验证、生物传感器开发、即时检测等领域展现出独特优势。与活细胞发酵相比，无细胞体系开放可控，可以实时监测反应进程，也免去了质粒转化和菌株筛选的漫长周期。
但CFES的制备成本高、耗时长，且通常需要在-80°C下保存。这种严苛的冷链要求极大限制了它在资源有限环境中的应用。冻干（lyophilization）提供了一种解决方案——通过添加保护性辅料将CFES制成固态，在常温下储存。然而，辅料在保护蛋白结构的同时，也会干扰后续的表达反应，保护与活性之间难以两全。
水熊虫是地球上最顽强的动物之一。这种体长不足1毫米的微型生物能在极端干燥、高温、辐射甚至真空中存活。其耐旱机制的核心是一类特有的 intrinsically disordered proteins——胞质丰富热溶性蛋白（CAHS proteins）。当水熊虫脱水时，这类蛋白会形成凝胶状网络，将细胞内的蛋白质和其他生物大分子包裹其中，防止它们在干燥过程中变性聚集。研究者想到：如果把这种天然保护机制引入无细胞表达系统，能否实现低成本室温干燥存储？
研究方法
质粒构建与菌株准备。 研究者采用Golden Gate组装策略构建所有质粒，遵循“Marburg collection”标准。用于Golden Gate组装的质粒通过NEB Monarch质粒小提试剂盒纯化，双报告质粒则使用Macherey-Nagel NucleoBond Xtra中提试剂盒，均按制造商说明书操作。密码子优化的水熊虫基因由GenScript公司合成。所有构建的质粒（论文补充表S1）均在大肠杆菌DH5α菌株中维持，经菌落PCR验证并测序确认。
双报告质粒psfGFP-MG携带强pTet启动子，因此维持在对该启动子有抑制作用的DH5αZ1菌株中。该质粒与pCAHS1质粒已通过Addgene平台共享（编号分别为#255770和#255769）。
裂解液制备。 裂解液来自携带自裂解质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，流程参照Didovyk等人描述的工作方案，并做了若干调整以改善可操作性及实现水熊虫基因的共表达。具体而言，将感受态BL21(DE3)共转化自裂解质粒pAD-LyseR（Addgene #99244）和可诱导的PrCAHS变体表达质粒（获得TL裂解液变体），或共转化pAD-LyseR和空载体（获得EL变体），在含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性LB琼脂平板上筛选。标准对照裂解液菌株（L变体）仅转化pAD-LyseR。
为获得用于裂解的生物量，研究者将过夜培养物接种于5 mL 2xYTPG培养基（补充葡萄糖至终浓度100 mM），在37°C、200 rpm条件下培养。次日，这些培养物用于接种800 mL含2xYTPG培养基的带挡板摇瓶。
CAHS蛋白整合。 裂解液制备采用Didovyk等人建立的自裂解方法——自裂解质粒表达λ噬菌体内溶素，通过冻融循环实现细胞裂解。为获得富含CAHS蛋白的裂解液，产裂解液菌株BL21(DE3)额外转化了一个携带CAHS基因的质粒，该基因受T7启动子诱导控制。在培养过程中诱导CAHS蛋白表达，随后将生物量加工为含CAHS蛋白变体的裂解液，置于常规真空干燥器中干燥。
蛋白检测。 通过12% SDS-PAGE确认最终裂解液中PrCAHS1蛋白的存在。凝胶上样顺序为：纯化的PrCAHS1（5 μL，50.82 μg）、蛋白标准品、不含CAHS蛋白的标准L裂解液（3 μL）、含PrCAHS1的水熊虫TL裂解液（分别上样1、3、5 μL）。所有裂解液样品在上样前均在95°C煮沸并离心。PrCAHS1的预期分子量为26.5 kDa。
论文摘要未详述真空干燥的具体参数（如干燥时间、真空度、温度），也未提供干燥后裂解液复水及活性检测的详细实验条件。这些细节需要查阅论文全文或补充材料。
研究结果
CAHS蛋白成功整合到裂解液中。 SDS-PAGE分析清晰显示，在TL裂解液中检测到与纯化PrCAHS1蛋白条带位置一致的蛋白带，分子量约26.5 kDa。随着TL裂解液上样量从1 μL增至5 μL，蛋白条带强度相应增加。而标准L裂解液在该位置无对应条带，排除了内源蛋白干扰。这表明通过共表达策略，CAHS蛋白成功富集于裂解液中，且未明显影响裂解液的整体蛋白组成。
室温干燥后活性保持。 研究者将含CAHS蛋白的TL裂解液和不含CAHS蛋白的对照裂解液在真空干燥器中室温干燥，随后复水检测其蛋白合成活性。结果显示，CAHS蛋白在没有任何其他添加剂的情况下，单独即可保护裂解液中的蛋白质合成机器免受干燥损伤。相反，未受保护的裂解液在干燥后，其mRNA合成动力学和翻译产量均受到明显影响。
论文摘要未提供具体活性数值（如干燥后相对活性百分比、mRNA产量变化倍数、蛋白合成效率等）。这些定量数据在摘要中未展示，需要查阅论文正文图表获取。
对转录与翻译的影响。 研究者使用双报告质粒分别监测转录和翻译过程——红色荧光信号报告转录活性，绿色荧光信号报告翻译活性。干燥处理后，未受保护的裂解液在mRNA合成动力学和翻译产量两个层面均出现损伤。而含CAHS蛋白的裂解液则保持了较好的转录和翻译功能。这表明CAHS蛋白的保护作用覆盖了从DNA转录到蛋白质合成的完整通路，而非仅针对某一环节。
论文摘要未提供转录速率、翻译效率的具体数值对比，也未给出干燥前后报告基因荧光强度的定量数据。
干燥方式的普适性。 值得注意的是，本研究的干燥方式并非传统的冻干（冷冻干燥），而是采用了成本更低的室温真空干燥。这是CAHS蛋白策略与以往冻干策略的关键差异——冻干需要昂贵的冷冻干燥设备，而室温真空干燥仅需常规真空干燥器即可完成。这大幅降低了设备门槛和能耗成本。
讨论与展望
这项工作的巧妙之处在于，它没有沿用“添加保护剂”的传统思路，而是从生物体本身的适应机制中寻找答案。水熊虫的CAHS蛋白在天然状态下就是为应对干燥胁迫而设计的——它能在脱水时形成凝胶网络，将胞内蛋白“封装”起来。将这种天然保护机制移植到无细胞表达系统中，不需要额外筛选保护剂配方，也避免了添加剂对后续反应的干扰。
研究选择PrCAHS1而非其他CAHS变体，可能与其表达水平和保护效率有关。水熊虫基因组编码多种CAHS蛋白，不同变体在序列和功能上存在差异，这为后续优化提供了广阔空间。正如论文所述，水熊虫来源的保护蛋白多样性是“无细胞合成生物学的宝库”。
当然，室温干燥存储的CFES要真正走向现场应用，还有一段路要走。干燥后裂解液的长期储存稳定性、不同批次间的一致性、以及大规模制备的经济性，都是需要进一步验证的问题。论文摘要未提供这些方面的数据，但可以想见，这将是该团队后续工作的重点方向。如果这一策略能够推广到其他类型的无细胞表达系统（如真核来源的裂解液），其应用场景将更加广阔。
参考来源
Meckelburg M, Banlaki I, Gaizauskaite A, Niederholtmeyer H. Tardigrade-Derived Strategy for Low-Cost Storage of Cell-Free Expression Lysates. ACS Synthetic Biology. PMID: 42319881. DOI: 10.1021/acssynbio.4c00821.
PMID: 42319881