来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷结构的稀有皂苷，生物活性显著，但栽培人参中天然不含这类化合物。本研究通过染色体水平基因组组装、比较基因组学与生化分析，在东北刺人参中鉴定出专职达玛二烯醇合酶OeOSC14，揭示其由祖先多功能三萜合酶经复制与新功能化进化而来。单个N260Y氨基酸替换即可逆转这一功能转变。研究进一步阐明C12羟化酶功能丧失阻断了RK型皂苷下游氧化步骤，并在本氏烟草中重建完整途径，实现Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为核心、经糖基修饰形成的高度多样化特殊代谢产物，已报道超过20,000种结构。它们在生态防御、根系微生物组塑造及作物品质调控中发挥重要作用，同时具有免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性。人参属植物含有数百种结构各异的人参皂苷，主要以达玛烷为骨架，在C-3、C-6和/或C-20位发生不同程度糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，疏水性较母体化合物增强。与新鲜人参组织中占主导的常规皂苷不同，RK型皂苷在栽培人参中几乎不存在，通常通过热处理或酸处理（如红参加工蒸制）过程中逐步脱糖获得。东北刺人参（Oplopanax elatus）是人参近缘种，能够积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，但其各组织中均不产生RK型皂苷。这一矛盾现象为解析RK型皂苷生物合成的进化机制提供了独特窗口。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培群体。该群体种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘使根系完整，快速清洗后立即投入液氮冷冻，随后保存于−80 °C备用。各组织类型的具体外观见图1B。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为生成PacBio HiFi长读长数据，取总计15 µg高分子量（HMW）DNA，使用gTUBEs剪切，随后采用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统进行大小选择，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi共有序列在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程构建Hi-C文库，并在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量控制
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读长结合Hi-C数据组装。首先使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤以获得高质量清洁读长（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读长使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定至染色体，利用Juicer v.1.65和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）处理Hi-C数据，执行contigs的过滤、排序和定向。最后使用Juicebox v.1.11.08手动校正组装，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，最终获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用从头预测与同源比对相结合的策略。首先使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后应用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外利用TRF v.4.09.1鉴定并注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq数据的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种蛋白序列用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）比对至组装基因组，随后使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果及对应基因结构。从头预测方面，先使用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，利用同源预测方法获得的基因结构训练HMM模型，再使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，RNA-seq数据先经HISAT2 v.2.2.1比对至基因组，比对读长用StringTie v.2.2.0组装为转录本，剪接位点经PASA_lite v.0.1.0验证并进一步优化转录本模型。最终，三种方法预测的基因模型用MAKER2整合生成高质量基因集。功能注释方面，预测基因的蛋白序列用BLASTP（E值<1e-10）比对至SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP命中分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涵盖东北刺人参及18个其他植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。基因家族使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取四重简并（4D）位点，使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然（ML）系统发育树，1000次自举重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的四重简并位点进一步用于PAML v4.9j包中MCMCTree程序估算物种分化时间。分歧时间在贝叶斯框架下采用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree使用的参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分歧时间。基因家族扩张与收缩使用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，区块内基因对间的Ks值使用PAML中codeml在F3X4模型下计算。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排序选择最佳命中基因对，使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2，基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT）对东北刺人参进行搜索，E值阈值<0.01。预测蛋白序列进一步使用SeqKit v.2.6.1软件按长度过滤：OSC长度为500–900个氨基酸，CYP和UGT长度为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员使用在线工具保守结构域数据库进行验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用已知功能的植物基因序列连同东北刺人参预测家族成员进行系统发育分析。分析所用全部序列列于补充数据3–6。多序列比对使用MAFFT v.7.518以默认参数进行。最大似然系统发育树使用FastTree v.2.2软件在默认设置下重建。所得Newick格式树使用在线平台Interactive Tree Of Life（iTOL）进行可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant RNA Kit提取总RNA，反转录合成cDNA。目标基因编码区序列经PCR扩增后，通过Gibson Assembly或限制性酶切连接方式克隆至植物双元表达载体（pCAMBIA系列载体，携带35S启动子），构建tHMGR、OeOSC、CYP和UGT等基因的过表达载体。重组质粒转化至农杆菌GV3101菌株，用于后续本氏烟草瞬时表达实验。载体构建所用引物序列见补充数据。
本氏烟草瞬时表达与代谢产物分析
将携带目标基因的农杆菌菌液重悬于侵染缓冲液（10 mM MES，10 mM MgCl₂，150 µM乙酰丁香酮，pH 5.6），调整OD₆₀₀至0.8–1.0。选取4–6周龄本氏烟草植株，用无针注射器将菌液渗透注入叶片。共表达组合包括tHMGR与各OeOSC基因，或tHMGR、OeOSC14、CYP及UGT基因组合。侵染后5–7天收取叶片，液氮研磨后加入乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸钠干燥、氮气吹干后，用适量甲醇复溶。代谢产物经GC–MS（m/z 189或202离子监测）或LC–MS（MRM模式监测特征离子对）分析。产物峰通过与纯品标准品比对保留时间和质谱裂解模式进行鉴定。三萜化合物绝对产量依据纯化标准品建立的标准曲线计算。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，此前根和根茎提取物研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参三萜骨架的多样性和组织特异性分布，对根、茎、根茎、叶和叶柄提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱裂解模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物的总离子流色谱图（TICs）和m/z 189提取离子流色谱图（EICs）显示，在37.15分钟处有一个显著未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征不同于α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇，无法据此进行结构鉴定（图1D）；因此，对叶片中P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱测定其结构，鉴定为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。随后，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，使用Rk1、Rk2和Rk3人参皂苷的商业化标准品进行了靶向LC–MS分析。这三种人参皂苷在东北刺人参叶片或任何其他受检组织中均未检出（图1E–G和补充图9）。综上，这些发现表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率高达8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读长和126.91 Gb（约71×）Hi-C读长用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定至24条假染色体的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。基于145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高支持度的分支：一支包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一支包含辽东楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。这一拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B形成两个独立分支，分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚类，这与涉及两个分化祖先谱系的共享异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种中也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能源自一个二倍体五加科样祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群（使用TimeTree化石校准）的MCMCTREE分歧时间估算将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，随后五加科两个主要谱系的分化约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参亚基因组A和B的分歧约在23.2百万年前，早于辽东楤木–人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种基因组，获得在东北刺人参中显著扩张或东北刺人参特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度表达，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与葡萄之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，异源四倍体物种（包括东北刺人参、刺五加和人参）表现出二倍体物种中不存在的额外Ks峰（约0.1处）。每个异源四倍体内两个亚基因组间的直系同源基因对也在约0.1处出现峰值。与此模式一致，共线性分析揭示葡萄、辽东楤木、人参和东北刺人参之间存在1:2:4:4关系，支持五加科在共享WGD之后发生了相对较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，推测其基因组编码一种氧化鲨烯环化酶（OSC），特异性催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛二烯醇。为验证这一假说，使用已知人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19；补充数据3）。
系统发育分析表明，这些OeOSC基因分布于不同OSC亚家族。为确定各OeOSC的催化功能，在本氏烟草叶片中将每个OeOSC基因与tHMGR（截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，用于提高甲羟戊酸途径通量）共表达，随后进行GC–MS分析。结果显示OeOSC14催化产生达玛二烯醇（图3B），其质谱裂解模式与从东北刺人参叶片纯化的天然化合物一致（图3C）。OeOSC14还产生少量β-香树脂醇。其他OeOSC基因则催化产生α-香树脂醇、β-香树脂醇、羽扇豆醇或达玛烯二醇II等不同三萜产物（图3B–E）。这些结果表明OeOSC14是东北刺人参中专职的达玛二烯醇合酶。
OeOSC14的进化起源与关键氨基酸功能切换
为追溯OeOSC14的进化起源，构建了包含双子叶植物中功能鉴定的OSC以及葡萄、半枝莲、艾草、积雪草和8个五加科物种全部预测OSC的最大似然系统发育树。结果显示OeOSC14与多功能三萜合酶（mTTS）亚家族聚类，特别是与催化达玛烯二醇II和β-香树脂醇产生的酶关系最近（图4A）。基因拷贝数分析显示，BAS（β-香树脂醇合酶）亚家族在五加科中普遍存在单拷贝或低拷贝，mTTS亚家族拷贝数在不同物种间变异较大，而DDS（达玛烯二醇合酶）亚家族仅存在于部分物种中（图4B）。共线性分析揭示了OSC位点在葡萄、半枝莲、艾草、积雪草和8个五加科物种间的微共线性关系（图4C）。功能验证实验显示，来自人参、刺五加和半枝莲的代表性mTTS酶均以β-香树脂醇和/或α-香树脂醇为主要产物，而非达玛二烯醇（图4D），表明达玛二烯醇合酶活性是东北刺人参OeOSC14的衍生特征。
多序列比对显示OeOSC14在第260位为天冬酰胺（N），而大多数mTTS在该位置为酪氨酸（Y）（图5A）。为验证该位点对催化特异性的决定作用，构建了OeOSC14 N260Y突变体，同时构建了半枝莲χAS的Y259N突变体和OeOSC12的Y260N突变体。GC–MS分析显示，OeOSC14 N260Y突变体从达玛二烯醇特异性合酶转变为多功能三萜合酶，产生β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图5B）。定量分析表明，OeOSC14 N260Y的β-香树脂醇产量达到野生型OeOSC14达玛二烯醇产量的可比水平（图5C）。反向突变SbχAS Y259N则使该酶从多功能合酶转变为达玛二烯醇特异性合酶，证实第260位残基是决定催化特异性的关键开关。分子对接模型显示，OeOSC14的N260残基位于活性口袋内，与底物的空间相互作用不同于含有Y260的mTTS酶（图5D）。这些结果共同表明，OeOSC14通过祖先mTTS基因复制后的新功能化进化而来，单个氨基酸替换（N260Y）即可逆转这一进化转变。
RK型人参皂苷生物合成途径的解析与重构
东北刺人参积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷，提示其缺乏下游修饰酶。在人参中，达玛烷型皂苷C-12位羟化由CYP716A47（原人参二醇合酶）催化，C-6位氧化由CYP716A53v2催化。为解析东北刺人参中RK型皂苷生物合成阻断的分子机制，对CYP基因家族进行了系统发育分析和跨物种共线性分析。结果显示，东北刺人参基因组中CYP716A47直系同源基因（OeCYP）存在功能缺失突变，导致C12羟化酶活性丧失（图6D、E）。这一发现解释了为何东北刺人参虽然积累达玛二烯醇却无法合成RK型人参皂苷——下游C12羟化步骤被阻断。
为验证这一假设并在植物中重建RK型人参皂苷生物合成途径，在本氏烟草中共表达tHMGR、OeOSC14、人参CYP716A47和CYP716A53v2以及UGT基因。GC–MS分析检测到与标准品保留时间一致的产物峰（图7A）。LC–MS分析显示，共表达tHMGR、OeOSC14、CYP716A47、CYP716A53v2和UGT的组合成功产生了人参皂苷Rk3（m/z 665.430，图7B）。进一步加入相应的UGT基因后，检测到Rk2（m/z 649.435）和Rk1（m/z 811.488）的产物峰（图7C）。产物结构经质谱裂解谱图确认（图7D）。定量分析显示，在本氏烟草中异源生物合成Rk1、Rk2和Rk3的产量分别为XX µg/g干重、XX µg/g干重和XX µg/g干重（图7E，原文具体数值未详述）。
讨论与解读
本研究通过染色体水平基因组组装和比较基因组学分析，揭示了东北刺人参中达玛二烯醇合酶OeOSC14的进化起源——由祖先多功能三萜合酶经基因复制和新功能化而来。关键的N260Y单氨基酸替换即可将达玛二烯醇特异性合酶逆转回多功能三萜合酶，这一发现为三萜环化酶的催化可塑性提供了精妙的分子证据。研究同时阐明，东北刺人参虽然积累达玛二烯醇，但因C12羟化酶功能缺失而无法完成RK型皂苷的后续修饰步骤。通过在本氏烟草中重建完整生物合成途径，成功实现了Rk1、Rk2和Rk3的从头异源合成。
编译者解读：该研究展示了"基因组挖掘—进化分析—生化验证—途径重构"的完整策略，为天然产物的异源生产提供了范式。利用近缘物种中"前体积累但终产物缺失"的天然系统来定位途径阻断点，这一思路值得合成生物学研究借鉴。单氨基酸突变对催化特异性的决定性影响也提示，在酶工程改造中应重点关注活性口袋关键残基。本氏烟草作为植物底盘的优势在于其具备完整的膜结合P450和UGT表达系统，适合复杂皂苷途径的快速验证。未来若将该途径转入经济作物或微生物底盘，有望实现RK型皂苷的规模化生产。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661