来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
L-色氨酸是重要的芳香族氨基酸，在食品、医药和饲料行业应用广泛。然而，复杂的代谢网络和多层级反馈调控让微生物高效生产L-色氨酸成为长期难题。近日，江南大学研究团队在《Microbial Cell Factories》发表研究，通过将基于tnaC的生物传感器与常压室温等离子体诱变结合，再配合系统代谢工程改造，成功构建了一株高效生产L-色氨酸的大肠杆菌细胞工厂。最终工程菌株W-24在5 L生物反应器中40小时产酸量达到50.83 g/L，糖酸转化率0.185 g/g葡萄糖。
研究背景
L-色氨酸的生物合成途径涉及中心碳代谢、芳香族氨基酸合成等多个模块，且受到转录水平和酶活水平的多重调控。传统菌株改造策略往往依赖随机诱变和反复筛选，效率低、周期长。近年来，代谢物生物传感器的发展为高通量筛选提供了新工具——通过将目标代谢物浓度转化为荧光信号，可以在海量突变文库中快速锁定高产菌株。
但生物传感器的灵敏度和检测范围往往受限，且单一改造策略难以同时解决碳流分配、辅因子供给、产物转运等多个瓶颈。本研究采取的策略是：先用生物传感器辅助筛选获得优良底盘菌株，再通过多模块代谢工程逐层打通合成通路，最后在发酵工艺层面做系统优化。
研究方法
菌株与载体系统。 研究以大肠杆菌W3110为出发菌株构建L-色氨酸生产菌。质粒克隆使用E. coli DH5α作为宿主，pTrc99A作为表达载体。基因组敲入和敲除操作基于CRISPR/Cas12a系统完成，该系统由pEcCpf1和pcrEG两个质粒组成。
CRISPR/Cas12a介导的基因组编辑。 以tktA基因整合至yncK位点为例，具体操作流程如下：以大肠杆菌基因组为模板，用引物对yncK-UP-F/yncK-UP-R和yncK-DO-F/yncK-DO-R分别扩增约500 bp的上游和下游同源臂；目标基因tktA由Ptrc启动子驱动，用引物tktA(Ptrc)-F和tktA-R扩增；随后通过Gibson assembly将同源臂和目标基因片段组装成供体DNA。特异性CRISPR RNA（crRNA）用CRISPR-DT工具设计，构建到辅助质粒pcrEG中获得引导质粒。基因敲入操作步骤参照该团队先前发表的方法。
生物传感器构建。 大肠杆菌tna操纵子的转录前导区含有一段72 bp的tnaC序列，编码24个氨基酸的前导肽TnaC。当胞内色氨酸达到阈值浓度时，TnaC调控Rho依赖性转录终止，从而增强下游tnaAB基因表达。基于这一调控机制，研究团队将含有天然tnaC前导序列和上游启动子的调控区，通过柔性连接肽（GGGGS）与绿色荧光蛋白（GFP）融合，克隆至pUC质粒，构建了生物传感器报告系统pUC-trpSensor。为提升灵敏度和扩大检测范围，用高敏变体tnaCR23F替换天然tnaC，获得改良型传感器pUC-trp*Sensor。
ARTP诱变与高通量筛选。 含生物传感器的模型菌株培养至指数生长期（约6–8小时），收集细胞后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，取10 µL细胞悬液点样于无菌金属片中心，进行常压室温等离子体（ARTP）诱变处理。原文摘要未详述ARTP处理的具体功率、时间等参数。
启动子工程与代谢通路优化。 为平衡L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的胞内供给，研究对相关基因的表达启动了启动子工程改造。原文未详述具体使用了哪些启动子变体及其强度差异。
产物转运系统改造。 为增强L-色氨酸的胞外分泌并缓解胞内毒性，研究对产物转运系统进行了工程改造。原文未详述具体改造的转运蛋白种类和表达水平。
发酵工艺优化。 在5 L生物反应器中，研究对接种量和补料策略进行了系统优化。原文摘要未详述具体的接种量比例、补料配方和流加策略。
研究结果
生物传感器性能验证。 研究在添加不同浓度L-色氨酸的培养基中表征了所构建传感器的响应特性。结果显示，改良型传感器pUC-trp*Sensor的检测范围扩展至0.05–1.00 g/L，而未修饰的原始传感器pUC-trpSensor检测范围仅为0.05–0.50 g/L。改良型传感器的检测上限提升了一倍。
底盘菌株筛选与代谢通路改造。 将pUC-trp*Sensor传感器与ARTP诱变相结合，研究团队从突变文库中筛选出高性能底盘菌株。随后对中心碳代谢进行重编程，以最小化碳流失并将代谢通量导向关键前体物质——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）。原文未详述具体重编程了哪些基因。
前体供给平衡。 通过启动子工程平衡L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和PRPP的胞内供给后，L-色氨酸积累量提升了21.61%。这一数据表明，前体供给的精细调控对最终产量有显著贡献。
产物转运与发酵放大。 完成产物转运系统改造后，研究进一步优化了5 L生物反应器中的接种量和补料策略。最终工程菌株W-24在40小时内产L-色氨酸50.83 g/L，糖酸转化率为0.185 g/g葡萄糖。
讨论与展望
这项研究的亮点在于"传感器引导+多模块迭代"的改造框架。先用生物传感器筛选底盘菌株，再依次打通碳流分配、前体供给、产物外排三大瓶颈——每一步都有明确的靶点和可量化的评估指标。21.61%的产量提升来自前体供给平衡这一步，说明在色氨酸合成路径中，L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和PRPP的供给确实是限速因素。
50.83 g/L的产量在摇瓶水平难以实现，5 L反应器中的补料策略优化贡献了相当部分增益。不过，0.185 g/g葡萄糖的转化率仍有提升空间——理论上，L-色氨酸对葡萄糖的理论转化率远高于此值，碳损失可能主要发生在细胞生长维持和副产物生成。后续研究若能在发酵工艺层面进一步优化，或对菌株做适应性进化，转化率有望再上一个台阶。
该研究建立的多模块工程框架不仅适用于L-色氨酸，也为其他芳香族化合物的微生物生产提供了可复制的技术路线。生物传感器与ARTP诱变的组合策略，尤其适合那些合成路径复杂、缺乏高效筛选方法的产物。
参考来源
Zhu R, Zhao Z, Shao W, Han J, You J. Biosensor-driven evolution and metabolic engineering of an Escherichia coli cell factory for L-tryptophan production. Microb Cell Fact. PMID: 42157063.
PMID: 42157063