敲除负调控基因plnD

📅 2026-08-11 📰 J Biol Eng 2026 Jul 29 📂 研究进展 👁 20

来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space

乳酸菌的基因编辑一直是个硬骨头。厚厚的肽聚糖细胞壁、低下的转化效率、菌株特异的限制修饰系统，再加上Cas9引发双链断裂带来的细胞毒性，让研究者屡屡碰壁。德国亚琛工业大学的研究团队没有绕开这些障碍，而是正面迎击——他们系统优化了转化条件和基因组编辑参数，在植物乳杆菌8P-A3中成功实现了CRISPR/Cas9介导的基因敲除。靶标是群体感应网络中关键的负调控基因plnD。敲除之后，plnA、plnE和plnF的表达量集体上调，抑菌活性也随之增强。这项工作发表在Journal of Biological Engineering上，通讯作者为Heine E，DOI对应PMID: 42527938。

研究背景

植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是食品工业和益生菌领域的重要菌种，能产生多种抗菌肽——细菌素。其中，plantaricin（植物乳杆菌素）的生物合成受群体感应（quorum sensing）系统精密调控。plnD编码的组氨酸激酶是这个调控网络中的关键传感器，负责感知外界信号并启动下游级联反应。

按理说，敲掉一个负调控基因，细菌素产量就能上去。但问题在于，植物乳杆菌的遗传操作实在太难。细胞壁厚，外源DNA进不去；进去了又被限制修饰系统降解；就算成功表达Cas9，双链断裂对细胞来说往往是致命的。这些技术瓶颈让许多实验室对乳酸菌的基因工程望而却步。

本研究选择了一条务实的路径：不开发全新的编辑工具，而是把一个已经验证过的CRISPR/Cas9双质粒系统，通过精细优化转化和编辑条件，硬生生地在植物乳杆菌8P-A3中跑通。目标很明确——破坏plnD基因，解除其对细菌素合成的抑制。

研究方法

菌株与培养条件

亲本菌株为植物乳杆菌8P-A3，2017年由俄罗斯实验医学研究所的Alexander Suvorov博士惠赠，最初分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum（Microgen，莫斯科）。基础培养基为MRS肉汤（Carl Roth GmbH，德国，货号HP64.1），pH 5.7。常规培养条件为37°C、150 rpm振荡，厌氧环境由BD GasPak™ EZ产气袋系统（货号260683，BD公司）配合指示剂维持，培养时间12至16小时。固体培养基使用MRS琼脂（Carl Roth GmbH，货号HP65.1）。

抗生素筛选时，在MRS培养基中添加相应抗生素，浓度依据质粒携带的抗性标记确定。原文摘要未详述具体抗生素种类及浓度，但后续质粒清除实验中提到了红霉素和氯霉素抗性的丢失，提示两种质粒分别携带这两个抗性标记。

电转化感受态细胞制备

这是整个流程中最考验耐心的环节。研究团队配制了两种关键溶液。MRS-G溶液：在25 mL MRS肉汤中加入0.625 g甘氨酸，配成2.5%的MRS-甘氨酸溶液，用0.22 μm滤膜过滤除菌。甘氨酸的作用是削弱细胞壁的肽聚糖交联，让细胞在电击时更容易接纳外源DNA。SacGly溶液：将85.55 g蔗糖溶于400 mL水，再加入100 mL 50%甘油，用于重悬洗涤细胞，提供高渗保护。

电击后的细胞复苏使用改良MRS培养基（MMRS），即在MRS肉汤中添加500 mM蔗糖、20 mM MgCl₂和2 mM CaCl₂。高渗蔗糖帮助受损细胞膜修复，二价阳离子则可能参与膜稳定性维持。

电穿孔参数

电转化使用Bio-Rad MicroPulser Electroporator（货号1652100），配合0.1 cm间隙的Gene Pulser/MicroPulser电转杯（货号1652093）。具体的电压、电阻、电容参数，原文摘要未详述。但0.1 cm的电极间隙意味着需要较高的场强，通常在10至18 kV/cm范围内——这是该规格电转杯的常见工作区间，具体数值以原文为准。

CRISPR/Cas9双质粒系统设计

编辑系统采用双质粒架构。CR质粒（pCB578）负责表达SpCas9蛋白、tracrRNA以及repeat-spacer-repeat结构单元——这是CRISPR系统加工crRNA并引导Cas9定位靶序列的核心组件。RT质粒（pCB591）则携带供体修复模板，内部含有一段针对plnD基因设计的内缺失/突变序列，用于引导同源定向修复（HDR）。

两个质粒的组装验证通过菌落PCR（cPCR）、限制性酶切和Sanger测序三重确认，结果见补充图S1至S4。验证无误后，两个质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3，获得CRM（CRISPR-modified）菌株。

编辑后质粒清除与突变体筛选

成功编辑后，需要把两个质粒从菌株中清除干净。研究团队在无抗生素培养基中进行连续传代培养。随着传代次数增加，质粒在分裂过程中逐渐丢失。通过筛选失去红霉素和氯霉素抗性的单菌落，即可判断质粒是否已被清除。抗生素敏感性恢复，说明两个质粒均已成功去除。

基因型验证

对plnA-plnD全基因座进行PCR扩增，使用侧翼引物覆盖整个区域。由于plnD内部发生了缺失突变，CRM菌株的PCR产物应当比野生型（WT）更短。琼脂糖凝胶电泳可以直观地比较条带大小差异。

进一步地，研究团队对编辑区域进行了靶向扩增子测序，从核苷酸水平确认编辑事件。测序数据分别用Geneious Prime、Benchling、SnapGene三个独立平台进行高严格度比对分析。三个平台的结果高度一致——HDR介导的缺失连接区域清晰可见，plnD基因区域内还伴随一些碱基突变。

关键的是，CRM等位基因完全丢失了完整的20 nt间隔序列识别位点以及紧邻的5'-NGG PAM基序。这意味着即使残留的Cas9蛋白再次表达，也无法识别这个位点——编辑事件是不可逆的。

▲ Quorum sensing–regulated plantaricin system in L. plantarum 8P-A3 strain (Figure adapted and modified from Goel, A. et al., 2023 [ 23 ] and Tsapieva, A. et al., 2011 [ 24 ]). Schematic representation of the plnABCD regulatory network. Extracellular PlnA activates the histidine kinase PlnB, which pho

研究结果

plnD基因敲除成功

双质粒CRISPR/Cas9系统在植物乳杆菌8P-A3中成功实现了plnD基因的程序化内缺失。经过无抗生素传代筛选，获得了同时失去红霉素和氯霉素抗性的菌落，证明两个质粒均已清除。PCR扩增结果显示，CRM菌株的plnA-plnD扩增产物明显短于野生型，与plnD内部缺失的预期一致（原文图5B）。

靶向扩增子测序进一步提供了核苷酸水平的铁证。三个独立比对平台（Geneious Prime、Benchling、SnapGene）均显示相同的HDR介导缺失连接，plnD基因区域内还有若干突变碱基。CRM等位基因缺失了完整的20 nt间隔序列识别位点和相邻的5'-NGG PAM基序——这一细节很重要，它彻底杜绝了Cas9的再次识别，保证了编辑的稳定性。

▲ Construction of the CRISPR targeting plasmid (pCB578) and recombineering template plasmid (pCB591). ( A ) 20-nt targeting spacer (S), flanked by a 36-nt CRISPR repeat (R) and overhangs compatible with PvuI and NotI restriction sites, was cloned into the pCB578 shuttle vector to generate the CRISPR (

细菌素合成相关基因上调

plnD编码的组氨酸激酶在plantaricin群体感应网络中扮演负调控角色。敲除plnD后，这个抑制信号被解除。RT-qPCR分析显示，CRM菌株中plnA、plnE和plnF的表达量均出现上调。这三个基因分别编码plantaricin生物合成通路中的不同组分——plnA编码诱导肽前体，plnE和plnF则参与细菌素的结构修饰或转运。具体上调倍数，原文摘要未提供具体数值。但基因表达的整体上升趋势明确，说明负调控解除后，整个细菌素合成通路被激活。

抗菌活性增强

基因表达的变化最终要落实到功能上。研究团队检测了CRM菌株的抗菌活性，结果显示其抑菌能力明显高于野生型菌株。具体的抑菌圈直径或最小抑菌浓度数值，原文摘要未详述。但结合基因表达数据，抗菌活性的提升与plnA、plnE、plnF的上调在逻辑上自洽——更多的结构基因表达，意味着更多的细菌素被合成和分泌。

▲ Workflow for CRISPR/Cas9–mediated genome editing in L. plantarum 8P-A3. Schematic overview of the complete genome-editing pipeline adapted for L. plantarum 8P-A3. The workflow is organized into three major stages: (i) construction of the recombineering template (RT) by cloning the plnD gene into pCB

编辑特异性与稳定性

测序结果确认，编辑仅发生在plnD基因区域，HDR介导的修复精确引入了设计的缺失突变。CRM等位基因中，间隔序列识别位点和PAM基序均被破坏，这不仅是编辑成功的标志，也是防止Cas9反复切割的保险机制。质粒清除后的菌株在无抗生素压力下依然保持编辑状态，说明基因组层面的改动是稳定遗传的。

讨论与展望

这项工作的价值不在于工具本身的新颖——CRISPR/Cas9在乳酸菌中的应用已有先例——而在于"优化"二字的分量。转化效率低、限制修饰系统活跃、Cas9毒性强，每一个环节都可能让实验止步不前。研究者通过调整感受态制备方案（甘氨酸处理削弱细胞壁）、优化电击参数、改进复苏培养基成分，把每个步骤的损失降到最低，最终让整个流程走通。

从调控逻辑上看，敲除plnD相当于拆掉了群体感应系统的"刹车"。plnA、plnE、plnF的上调说明，一旦负调控解除，细菌素合成通路就能自发激活。这提示我们，不需要对所有基因进行过表达改造，精准地移除一个关键抑制节点，就能撬动整个代谢网络的产出。

当然，这项研究仍有未展开的面向。plnD敲除后，群体感应对其他生理过程的影响尚未探讨；抗菌活性的提升幅度在不同指示菌株上是否一致，也未在摘要中说明。但就"理性重构群体感应调控回路以提高细菌素产量"这一目标而言，这项工作给出了一个干净利落的示范。对于食品级乳酸菌的工程化改造，这套优化后的流程提供了一个可以直接借鉴的操作模板。

参考来源

Anand R, Lütticken R, De Laporte L, Herrmann A, Heine E. An optimized CRISPR/Cas9-based genome editing platform enhances bacteriocin production in Lactiplantibacillus plantarum. J Biol Eng. PMID: 42527938.

PMID: 42527938

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