来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理产生的低pH、高温及发酵抑制物等苛刻条件对宿主微生物提出了极高要求。本研究以具有卓越多重胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现模式酵母酿酒酵母的展示系统在该酵母中失效后，基于其内源IoSED1基因构建了新型细胞表面展示盒，成功实现了增强型绿色荧光蛋白和β-葡萄糖苷酶的细胞表面展示，并在纤维二糖为唯一碳源及抑制物存在的条件下实现了稳健生长。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了对非化石基可持续生产系统的需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因其来源丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素三种结构聚合物组成，前两者可通过化学和酶处理水解为可发酵单糖，进而由代谢工程微生物转化为生物基化学品和燃料。
酵母因抗噬菌体感染、易于遗传操作及异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化中颇具潜力的宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白的锚定结构域将纤维素酶展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的酸性热化学预处理会形成低pH、高温及抑制物共存的严苛培养环境，这就要求展示纤维素酶的宿主菌株具备突出的胁迫耐受性。本研究选用具有卓越多重胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母，尝试在该酵母中建立细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
Escherichia coli NovaBlue菌株（Novagen, WI, USA）用作重组DNA操作宿主。E. coli转化子在添加100 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠）中于37 °C培养。本研究所用I. orientalis野生型菌株为从NITE生物资源中心（NBRC, 东京, 日本）获得的11株菌，S. cerevisiae野生型菌株为BY4741（Life Technologies, CA, USA）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母生长培养基为YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto-蛋白胨[Difco Laboratories, MI, USA]、20 g/L葡萄糖）、缺乏尿嘧啶的合成完全（SC-URA） dropout培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱[Difco Laboratories]、1.92 g/L无尿嘧啶酵母合成dropout培养基补充物[Sigma-Aldrich, MO, USA]、20 g/L葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱[Difco Laboratories]、20 g/L葡萄糖）。
I. orientalis NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将I. orientalis和S. cerevisiae细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基的初始pH分别用1 M HCl和0.5 M KOH调至2或6。使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC, 东京, 日本）在L形管中于30 °C或45 °C、40 rpm条件下培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香草醛）的耐受性，将细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备培养物的系列稀释液（OD600为1、0.1、0.01或0.001）。然后，将各稀释液3 µL点样于补充有尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香草醛10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，使用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics, 东京, 日本）记录菌落生长情况。
I. orientalis NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka, 大阪, 日本）提取I. orientalis NBRC1664基因组DNA。用URA3-UP-F和URA3-UP-R引物及URA3-DOWN-F和URA3-DOWN-R引物（Xiao等, 2014）分别通过聚合酶链式反应（PCR）扩增I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂。这些片段通过重叠延伸PCR融合，所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在补充有1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。通过使用Colony-P-F和Colony-P-R引物的菌落PCR确认IoURA3 ORF的缺失。为验证尿嘧啶营养缺陷型，将转化子在含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板上划线并于30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio, 滋贺, 日本）按制造商说明书构建。本研究所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
用URA3-F和Colony-P-R引物通过PCR从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IoURA3基因DNA片段。将扩增片段导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到pVT。用ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR从质粒pleGFP-SSS（Inokuma等, 2020）扩增增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达盒，然后导入pVT的SacI位点，得到质粒pVT-SceGFP。
用IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物通过PCR从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增除去分泌信号后的IoSED1编码区（表S4）。将扩增片段与以质粒plBG-SSS（Inokuma等, 2016）为模板、用Vector-F和Vector-R引物PCR产生的DNA片段融合。所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定结构域被替换为IoSED1锚定结构域。用于以IoSED1启动子、分泌信号和锚定结构域展示eGFP的质粒构建如下：用IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物通过PCR从I. orientalis NBRC10737基因组DNA扩增含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段。用eGFP-F和eGFP-R引物通过PCR从pleGFP-SSS扩增eGFP编码区DNA片段。用IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物通过PCR从plBG-SSIoS扩增编码IoSED1锚定结构域的DNA片段。将这三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入I. orientalis NBRC1664染色体2先前鉴定的基因间位点IS2（Lee等, 2022）的整合型质粒构建如下：用IS2-UP-F和IS2-UP-R引物及IS2-DOWN-F和IS2-DOWN-R引物分别从I. orientalis NBRC1664基因组DNA扩增IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段。在IS2-UP-R的重叠区域插入PacI识别位点。这两个DNA片段通过重叠延伸PCR融合，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。将该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。用IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物通过PCR扩增pVT-IoeGFP中用于展示eGFP的基因表达盒，所得片段导入pVT-IS的SacI位点。所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于细胞表面展示A. aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：用IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R2引物及IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物分别从pVT-IoeGFP扩增IoSED1启动子和分泌信号及IoSED1锚定结构域的DNA片段。用BGL-F和BGL-R引物通过PCR从plBG-SSS扩增编码A. aculeatus BGL1的DNA片段。将这三个片段导入pVT-IS的SacI位点。所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的I. orientalis菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT同样导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。对于eGFP展示盒的基因组整合，将整合型质粒pVT-IS-IoeGFP用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的I. orientalis菌株，将整合型质粒pVT-IS-IoBGL用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，获得16-IoBG-int菌株。
所有I. orientalis菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照先前报道（Xiao等, 2014）并稍作修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养。取等分试样接种至3 mL新鲜YPD培养基中……
研究结果
I. orientalis NBRC1664胁迫耐受性的评估
为比较I. orientalis与模式酵母S. cerevisiae的多重胁迫耐受性，本研究评估了从NBRC获得的11株I. orientalis中耐受性最强的NBRC1664菌株（图S1）及S. cerevisiae BY4741在低pH、高温和木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，两种菌在pH 6时均生长良好，但I. orientalis的生长优于S. cerevisiae。I. orientalis在pH 2时表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6时几乎相同，而S. cerevisiae在pH 2时无法生长。类似地，I. orientalis在45 °C下成功生长而S. cerevisiae不能；两种菌在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香草醛）存在下的生长情况，进行了点样分析（图1c）。本研究所用各抑制物的浓度处于木质纤维素水解液中观察到的范围内（Mills等, 2009）。两种菌在补充适当营养物的SD培养基上、非胁迫条件下均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis在所有三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而S. cerevisiae在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上，这些结果表明I. orientalis NBRC1664具有卓越的多重胁迫耐受性。
展示eGFP的I. orientalis菌株的评估
为确定与GPI锚定结构域融合的蛋白能否固定在I. orientalis细胞表面，本研究构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达先前在S. cerevisiae细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma等, 2020），该表达盒由S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定结构域及S. cerevisiae SAG1终止子组成（图2a）。将携带该表达盒的附加型质粒（pVT-SceGFP）导入I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株——该尿嘧啶营养缺陷型菌株的尿嘧啶缺陷型已通过生长分析确认（图S2），并按"材料与方法"所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
接下来，本研究假设荧光缺失源于异源遗传元件在该表达盒中于I. orientalis内功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定结构域对展示效率有决定性影响（Inokuma等, 2014, 2016; Zhang等, 2013）。因此，本研究构建了修饰型展示盒，其中各元件均被替换为IoSED1基因的对应元件（图2a）——IoSED1与ScSED1基因同源（Kitagawa等, 2010），且根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber等, 2004）预测编码GPI锚定蛋白。此外，源自IoSED1基因的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa等, 2010）。将这一新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察到清晰的表面定位荧光（图2b）。荧光模式与展示eGFP的S. cerevisiae菌株中观察到的结果（Inokuma等, 2020）相当，表明eGFP成功展示在I. orientalis细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅在少数细胞中观察到荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，本研究将展示盒整合至基因组。按"材料与方法"所述构建了设计用于将表达盒插入I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee等, 2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，呈现清晰表面定位信号的细胞比例显著增大（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综上，这些结果证明成功构建了能够在I. orientalis细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的I. orientalis菌株的评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，本研究构建了展示A. aculeatus BGL1的I. orientalis菌株——BGL1可将纤维二糖水解为葡萄糖（Murao等, 1988），获得16-IoBG-int菌株（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h，之后在30 °C下评估细胞组分和培养上清中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清中均未检测到BGL活性。相反，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL成功展示在I. orientalis细胞表面。
此外，为评估所展示的A. aculeatus BGL1在LCB生物转化中预期的高温条件下的活性（Yanase等, 2010），将在30 °C培养72 h的细胞在45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著升高至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与A. aculeatus BGL1的最适温度位于50 °C以上高温范围的事实一致（Murao等, 1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的展示BGL的菌株是否能……
讨论与解读
本研究开发了一种适用于多重胁迫耐受酵母I. orientalis的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株以纤维二糖为唯一碳源时表现出稳健生长。更重要的是，该菌株在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的I. orientalis菌株非常适合高效的LCB生物转化。
本研究采用源自IoSED1基因的启动子、分泌信号和锚定结构域构建了新型基因表达盒，并成功展示了eGFP（图2b）。研究发现，与附加型质粒表达系统相比，表达盒的基因组整合显著提高了细胞表面呈现eGFP荧光的细胞比例，提示质粒型表达在I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。这一解释与先前报道一致——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的附加型质粒在另一I. orientalis菌株中表现出不稳定性（Tran等, 2019; Cao等, 2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍观察到部分无荧光细胞（图2b和图S3）。值得注意的是，如图2b所示，体积较小的细胞几乎不显示荧光。
编译者解读
本研究的关键价值在于将细胞表面展示技术从模式酵母拓展至工业相关的胁迫耐受酵母——东方伊萨酵母。方法上最值得借鉴的决策是：当酿酒酵母来源的展示元件失效时，果断替换为宿主内源IoSED1的对应元件，这体现了"宿主适配"在合成生物学中的核心地位。基因组整合策略有效解决了质粒不稳定的瓶颈，为后续放大应用奠定了基础。从应用角度看，BGL展示菌株在抑制物存在下仍能以纤维二糖为唯一碳源生长，直接回应了LCB生物转化中"酶成本高、步骤繁琐"的痛点。未来若能将纤维素酶与半纤维素酶共展示，并进一步优化整合位点与拷贝数，该平台在整合生物加工（CBP）中的潜力值得期待。局限在于目前仅验证了单一纤维素酶，且抑制物条件下的生长速率仍有提升空间。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235