来源：ACS Synth Biol | 编译：DNA Lab Space
无细胞表达系统（CFES）正在成为合成生物学快速原型验证的重要工具，但严苛的冷冻储存条件始终是它走出实验室的绊脚石。一项发表于《ACS Synthetic Biology》的最新研究，从水熊虫——这种以极端环境耐受能力著称的微小生物——身上找到了解决方案：仅凭一种来自水熊虫的胞质丰富热溶性（CAHS）蛋白，无需任何其他添加剂，就能让无细胞表达裂解液在低成本室温干燥后保留蛋白质合成活性。这一策略有望大幅降低CFES的制备和运输成本，推动其在资源有限环境中的实际应用。
研究背景
无细胞表达系统绕过了细胞培养的繁琐流程，通过直接混合裂解液、模板DNA和反应底物，就能在体外完成转录和翻译。这种"即开即用"的特性让它在快速原型验证、生物传感器开发和按需生产等领域备受青睐。然而，CFES的裂解液本质上是复杂的生物混合物，其中核糖体、聚合酶等核心组件对温度极为敏感。传统上，这些裂解液必须在-80°C甚至液氮中保存，运输过程需要干冰冷链，这极大限制了它在偏远地区或现场场景中的使用。
此前的研究尝试过用冻干法配合保护添加剂来制备固态CFES，但保护剂本身往往会对表达活性造成干扰——保护效果和活性保留之间难以两全。水熊虫能在脱水、辐射、真空等极端条件下存活，其体内大量表达的CAHS蛋白被认为是关键保护因子之一。这种蛋白能在干燥条件下形成凝胶状网络，将客户蛋白包裹其中，防止它们在失水过程中变性聚集。研究者设想，如果将这种天然的保护机制引入无细胞表达系统，或许能在不添加外源保护剂的情况下实现室温干燥存储。
研究方法
质粒构建与菌株准备
研究团队采用Golden Gate组装策略构建所有质粒，使用的载体骨架来自"马尔堡集合"（Marburg collection）。用于Golden Gate组装的质粒通过NEB Monarch质粒小提试剂盒纯化，双报告质粒则使用Macherey-Nagel NucleoBond Xtra中提试剂盒纯化，均按制造商说明书操作。密码子优化的水熊虫基因由GenScript公司合成。所有构建的质粒（详见表S1）均保存在DH5α菌株中，通过菌落PCR验证并经测序确认。
关键的双报告质粒psfGFP-MG（Addgene #255770）携带强pTet启动子，因此保存在DH5αZ1菌株中以抑制其基础表达。用于表达CAHS蛋白的质粒pCAHS1（Addgene #255769）则单独构建。这两个质粒的序列信息已公开，便于其他研究者直接获取使用。
裂解液制备
裂解液来自携带自裂解质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，整体流程参照Didovyk等人描述的自裂解方法，并做了若干调整以同时实现水熊虫基因的共表达。具体来说，将感受态BL21(DE3)共转化两个质粒：自裂解质粒pAD-LyseR（Addgene #99244）和可诱导的PrCAHS变体表达质粒（产生"水熊虫裂解液"TL变体），或空载体（产生"空载体裂解液"EL变体）。标准对照裂解液菌株（L变体）仅转化pAD-LyseR。转化后在含氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性LB琼脂平板上筛选。
生物量制备分两步进行：首先将过夜培养物接种到5 mL 2xYTPG培养基中（补充葡萄糖至终浓度100 mM），在37°C、200 rpm条件下振荡培养；次日将这些培养物转移到含800 mL 2xYTPG培养基的带挡板摇瓶中扩大培养。培养过程中，通过诱导T7启动子表达CAHS蛋白。收获菌体后，利用自裂解质粒产生的λ噬菌体胞内溶素，通过冻融循环实现细胞裂解。裂解液经离心去除细胞碎片后，即为含有CAHS蛋白的粗提物。
干燥处理
含有CAHS蛋白变体的裂解液在常规真空干燥器中进行室温脱水干燥。整个过程不添加任何冻干保护剂或其他添加剂——这是该策略与既往冻干法最本质的区别。干燥后的裂解液在室温条件下保存，用于后续活性测试。
活性检测体系
研究采用双报告质粒系统同时监测转录和翻译过程：红色荧光蛋白信号报告转录活性，超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）信号报告翻译活性。通过比较干燥前后、有无CAHS蛋白的裂解液在各时间点的荧光强度，可以定量评估干燥处理对无细胞表达系统核心功能的影响。
研究结果
CAHS蛋白成功整合入裂解液制备流程
SDS-PAGE分析（12%凝胶）确认了PrCAHS1蛋白在最终裂解液中的存在。凝胶结果显示，纯化的PrCAHS1蛋白（上样5 μL，含量50.82 μg）在预期位置出现清晰条带，而标准L裂解液（不含CAHS蛋白，上样3 μL）在该位置无条带。TL裂解液以1、3、5 μL三个梯度上样，均可见PrCAHS1蛋白条带，且条带强度随上样量增加而增强。PrCAHS1蛋白的预期分子量为26.5 kDa。值得注意的是，所有裂解液样品在凝胶电泳前均经95°C煮沸并离心处理——这一步骤能沉淀大部分杂蛋白，而热溶性CAHS蛋白仍保留在上清中，这也验证了其"热溶性"的特性。
CAHS蛋白单独即可保护翻译活性
功能测试结果显示，含有CAHS蛋白的TL裂解液在室温干燥后，蛋白质合成活性得到有效保留。相比之下，不含CAHS蛋白的对照裂解液（EL变体和标准L变体）在相同干燥处理后，mRNA合成动力学和翻译产量均受到明显影响。具体而言，未受保护的裂解液在干燥后转录和翻译效率均出现显著下降，而CAHS蛋白的存在为生物合成机器提供了有效的干燥保护。这一结果的关键在于——CAHS蛋白是唯一添加的保护因子，没有辅以任何糖类、多元醇或其他常用冻干保护剂。
干燥保护机制与CAHS蛋白网络结构相关
研究者根据CAHS蛋白的已知结构特征提出了保护机制模型：CAHS单体在干燥条件下发生构象转变，组装成网格状网络结构，将客户蛋白（包括核糖体、聚合酶等无细胞表达系统的核心组件）包裹在网格内部，从而在脱水过程中维持其天然构象。这一机制与既往报道的冻干保护剂（如海藻糖通过玻璃态形成保护）有本质区别——CAHS蛋白是通过形成物理网络而非改变溶剂环境来实现保护。
讨论与展望
这项研究的核心价值在于证明了单一蛋白质组分就能替代复杂的化学保护剂组合，实现无细胞表达系统的室温干燥存储。从实用角度看，CAHS蛋白可以在裂解液制备过程中通过共表达的方式同步获得，不需要额外的纯化和添加步骤，这极大简化了生产流程。从成本角度看，室温干燥和储存意味着摆脱了对-80°C冰箱和干冰运输的依赖，这对资源有限的实验室和现场应用场景尤为重要。
研究选择PrCAHS1而非其他水熊虫蛋白，可能与其在天然水熊虫细胞中的高丰度表达有关——自然界已经验证了它的保护效力。当然，水熊虫体内还存在多种CAHS家族蛋白以及其他类保护蛋白（如SAHS、MAHS等），这些蛋白是否具有协同效应或各自针对不同的损伤机制，原文摘要未详述。此外，干燥后的裂解液在室温下能保持多长时间的活性、是否需要控制湿度等具体储存条件，原文摘要也未提供详细参数。这些问题的答案将决定该技术能否从实验室走向实际应用。水熊虫来源的保护蛋白家族，正为无细胞合成生物学打开一扇通往便携化、低成本化的大门。
参考来源
Meckelburg M, Banlaki I, Gaizauskaite A, Niederholtmeyer H. Tardigrade-Derived Strategy for Low-Cost Storage of Cell-Free Expression Lysates. ACS Synthetic Biology. PMID: 42319881. DOI: 10.1021/acssynbio.4c00856.
PMID: 42319881