来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）正从实验室 curiosum 走向工业生物制造的前台。这种由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接的多糖，兼具刚性链段与柔性区域，流变学行为独特，在食品、医药和材料领域都有想象空间。然而，其生物合成机制长期存在一块拼图缺失：负责将多糖运出细胞的外膜蛋白是谁？2025年发表在《Microbial Biotechnology》上的一项研究给出了答案——TolC。作者不仅鉴定出这一关键组分，还通过共过表达策略将MLG产量推高至每升10克，并成功让非产MLG的根瘤菌宿主"跨界"合成该多糖。
研究背景
MLG在植物细胞壁和部分微生物胞外多糖中都存在，但微生物来源的MLG因其结构均一性和可发酵生产特性，被视为更可控的原料来源。在苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）中，MLG的合成由双顺反子操纵子bgsBA编码，受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控。BgsA负责糖链延伸，BgsB的功能尚不完全清楚，但学界普遍怀疑存在第三个组分——一个外膜通道蛋白，负责将合成好的多糖分泌到胞外。
此前的研究已发现，TolC家族蛋白在多种革兰氏阴性菌中充当外膜通道，与内膜转运体形成三组分复合物，泵出底物。但在MLG合成体系中，TolC是否参与、如何参与，始终没有直接证据。此外，如何通过代谢工程提高MLG产量，也缺乏系统策略。这项研究正是从这两个缺口切入：先确认TolC的必需性，再构建高表达模块测试增产潜力。
研究方法
菌株与培养条件。研究涉及四种菌：苜蓿中华根瘤菌（S. meliloti）、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）、菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）以及用于克隆和接合转移的大肠杆菌。根瘤菌常规培养于添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY），或使用最小培养基（MM）。MM配方为每升含：10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃、0.05 g NaCl，另加1 mL 1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素、0.1 g/L泛酸钠）。S. meliloti和M. japonicum在28°C培养，R. etli在30°C培养，大肠杆菌在37°C LB培养基中培养。抗生素终浓度：四环素10 μg/mL（R. etli用5 μg/mL）、卡那霉素50 μg/mL、刚果红50 μg/mL、荧光增白剂CF 200 μg/mL、IPTG 1 mM。质粒通过大肠杆菌β2163或S17.1供体菌接合转移进入根瘤菌。
MLG定量方法。采用地衣多糖酶（lichenase）消化后测定释放的葡萄糖当量，方法参照Marchante等（2024）的描述。摇瓶培养条件：100 mL锥形瓶装20 mL含四环素的液体MM，S. meliloti于28°C、R. etli于30°C，170 rpm振荡培养3天，初始OD₆₀₀调至0.05。
三突变体构建。为排除其他c-di-GMP调控的胞外多糖对MLG产量的干扰，研究者构建了同时缺失EPS II、EPS I和APS合成的三突变体IBR606。具体做法是对wgcA（EPS II）、exoY（EPS I）和uxs1-uxe（APS）三个基因进行框内缺失，逐一引入突变，并用PCR和表型观察双重确认。
TolC功能验证。对tolC基因进行遗传破坏，观察MLG合成是否丧失；再通过质粒回补tolC，检测产量是否恢复。这是证明必需性的经典遗传学逻辑。
过表达模块构建。将tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶基因pleD***共同置于质粒上过表达，以不含tolC*的对照质粒为参照，比较MLG产量差异。生物反应器条件下测试最终产量。
异源表达实验。将上述遗传模块转入非产MLG的根瘤菌宿主（如M. japonicum），检测是否获得从头合成MLG的能力。
研究结果
TolC是MLG合成的必需因子。遗传破坏tolC后，S. meliloti完全丧失MLG合成能力；回补tolC则恢复生产。这一结果将TolC从"候选外膜通道"提升为"必需的合成机器组件"。作者据此提出，TolC与BgsA、BgsB形成三组分复合物，协同完成多糖的聚合与分泌。
排除其他EPS的干扰。三突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）在生理c-di-GMP水平下，MLG产量与野生型一样低于检测限——说明EPS I、EPS II和APS的缺失本身不足以启动MLG大量合成。引入携带pleD***的质粒pJBpleD后，IBR606的MLG产量被显著激活，略高于野生型背景，但差异未达统计学显著水平。这表明，其他c-di-GMP调控的EPS并非MLG合成的"竞争者"，至少不是限速因素。
共过表达实现8倍增产。将tolC、bgsBA和pleD***共过表达，MLG产量较不含tolC的对照质粒提升8倍。在生物反应器条件下，产量达到约10 g/L。这个数字值得注意——它意味着TolC不仅是合成所必需，还是产量天花板的关键决定因素。没有TolC的过表达模块，即便有bgsBA*和二鸟苷酸环化酶，产量也远低于含TolC的版本。
模块可移植性验证。将完整的遗传模块转入非产MLG的M. japonicum，成功实现了MLG的从头合成。这证明该模块不依赖S. meliloti特有的辅助因子，可以在其他根瘤菌底盘菌株中工作。对于合成生物学而言，这意味着底盘菌株的选择可以更灵活——不必局限于天然产MLG的物种。
讨论与展望
TolC的鉴定补齐了MLG生物合成机器的最后一块拼图。三组分复合物的模型——内膜催化亚基BgsA、膜融合蛋白BgsB、外膜通道TolC——与大肠杆菌中多种药物外排泵的架构高度相似，这提示MLG的分泌可能采用了在革兰氏阴性菌中广泛保守的"三组分外排"范式。该研究选择共过表达而非单独过表达TolC，可能正是考虑到复合物组装的化学计量比——单一组分过量未必有效，协同表达才匹配天然装配过程。
10 g/L的产量在微生物多糖领域属于有竞争力的水平，但距离工业化仍有距离。发酵条件优化、菌株适应性进化、以及利用CRISPR等工具精细调控c-di-GMP水平，都是潜在的提升方向。模块在M. japonicum中的成功表达，也为在生长更快、遗传操作更简便的宿主中建立生产体系打开了大门。一个值得追问的问题是：TolC是否也能提升其他依赖三组分复合物分泌的多糖产量？这或许是该发现最直接的延伸方向。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology, 2025. PMID: 42552791.
PMID: 42552791