来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
从甲醇到黑色素，这条看似遥远的合成路线，如今被一群研究者走通了。他们利用工程化Komagataella phaffii（即毕赤酵母），将尿黑酸产量提升了66倍，并进一步通过氧化聚合获得焦黑素。5升发酵罐中204小时高密度发酵，最高产量达到70.5 ± 0.7 g/L。这项研究发表在Nature Communications上。
焦黑素应用广泛，但天然产物的产量一直不高。微生物合成被视为可持续且经济可行的替代路径。该研究不仅搭建了高效合成路线，还建立了基于颜色的筛选系统，用于酶定向进化和半理性改造。最终，他们展示了焦黑素的实际应用潜力。
研究背景
焦黑素属于真黑色素家族，由尿黑酸氧化聚合而成。它在紫外线防护、抗氧化、光电材料、药物递送等多个领域都有应用价值。然而，从天然生产者中直接提取焦黑素，产量低、成本高，难以满足工业需求。
微生物细胞工厂提供了一条新路。通过引入异源酶、强化内源代谢通量，可以在发酵罐中大规模合成目标产物。但焦黑素的微生物合成面临多重挑战：前体供应不足、关键酶催化效率低、聚合过程难以控制等。
毕赤酵母K. phaffii是成熟的工业蛋白表达宿主，具备甲醇利用能力、高密度发酵特性和良好的遗传操作性。该研究选择它作为底盘细胞，试图解决焦黑素产量低的瓶颈问题。
研究方法
菌株与质粒构建
研究使用的菌株和质粒信息列于补充数据中。K. phaffii GS115（Invitrogen）作为宿主菌株，Escherichia coli TOP10F'用于质粒构建和扩增，E. coli BL21(DE3)（Sangon Biotech，上海）用于蛋白表达。考虑到遗传稳定性，基因过表达整合采用了pZACH质粒。Cre/loxP ZeoR标记循环回收方法保证了每次整合的稳定性。基因敲除使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达和纯化使用pET-28a质粒。编码异源酪氨酸转氨酶（TYRB）和羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）的基因经过密码子优化，由Generay（上海）合成。
培养基与培养条件
所有E. coli菌株在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37°C培养。重组酵母菌株在YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）或BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）中培养。
HGA生物合成途径的构建
K. phaffii具有天然的HGA合成途径。研究首先测试了野生型（WT）菌株的HGA生产能力。摇瓶发酵5天后，HGA产量达到25 ± 0.85 mg/L，但上清液未见明显颜色变化，OD400仅为0.006。随后向培养基中补充不同浓度的L-酪氨酸，HGA产量并未显著提升。这些结果表明，K. phaffii中催化L-酪氨酸转化为HGA的酶HPPD和TYRB催化效率较低。
研究者因此寻找替代酶源。他们筛选了不同来源的HPPD和TYRB基因，发现来自Alcaligenes faecalis的HPPD和来自Yarrowia lipolytica的TYRB能显著提升HGA产量。与TYRB相比，HPPD过表达对HGA产量的影响更大，这与文献报道HPPD是HGA生物合成途径关键酶一致。
多拷贝整合是提高目标产物产量的有效策略。研究者进一步通过多拷贝整合优化AfHPPD表达。携带三个AfHPPD拷贝（整合在不同位点HIS4、INT1和INT18）的菌株Pyo9，HGA产量达到最高64.1 ± 0.68 mg/L。与WT菌株相比，其上清液呈现更深的浅棕色，OD400为0.362，这可能是HGA自氧化聚合所致。
三种生物合成模块的平衡
论文摘要提到，通过平衡三种不同的生物合成模块，HGA产量提升了66倍。原文摘要未详述三种模块的具体划分和平衡策略的具体操作参数。从上下文推断，三种模块可能涉及前体供应、关键酶表达和聚合过程，但具体细节需查阅全文。
颜色筛选系统的建立与应用
研究建立了焦黑素颜色筛选系统。该系统利用HGA氧化聚合产生颜色的特性，通过肉眼或OD400值判断菌株的HGA生产能力。该系统被应用于3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的定向进化，以及羟苯基丙酮酸双加氧酶的半理性设计改造。原文摘要未详述定向进化和半理性设计的具体筛选轮数、突变文库大小和筛选条件。
焦黑素合成与表征
研究比较了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理两种焦黑素合成方式的差异。原文摘要未详述两种聚合方式的具体反应条件（如pH、温度、酶用量、反应时间）和产物性质的差异细节。
高密度发酵
在5升发酵罐中进行高密度发酵，持续204小时。菌株Pyo29达到最高产量70.5 ± 0.7 g/L。原文未详述发酵过程中的具体参数，如温度控制、pH维持、甲醇流加策略、搅拌转速和溶氧控制等。
研究结果
HGA生物合成途径的构建
野生型K. phaffii菌株在摇瓶发酵5天后，HGA产量为25 ± 0.85 mg/L，上清液无可见颜色变化，OD400为0.006。补充L-酪氨酸未能显著提升产量，说明内源HPPD和TYRB催化效率低下。
引入异源酶后情况大为改观。来自Alcaligenes faecalis的HPPD和来自Yarrowia lipolytica的TYRB显著增强了HGA合成。其中HPPD过表达的效果更为突出，印证了HPPD是HGA合成途径的关键酶。
通过多拷贝整合策略，携带三个AfHPPD拷贝的菌株Pyo9，HGA产量达到64.1 ± 0.68 mg/L，是WT菌株的2.6倍。其上清液呈现浅棕色，OD400为0.362，明显高于WT菌株的0.006。
三种模块平衡与产量提升
通过平衡三种不同的生物合成模块，HGA产量最终提升了66倍。这一数据表明，单纯的酶过表达还不够，需要系统性地协调各模块间的代谢通量。原文摘要未提供各模块平衡前后的具体产量数据对比。
颜色筛选系统与酶改造
颜色筛选系统的建立是本研究的方法学亮点。该系统利用HGA氧化聚合产生颜色的特性，实现了对菌株HGA生产能力的快速可视化判断。将该系统应用于DAHP合成酶的定向进化和HPPD的半理性设计改造，进一步提升了HGA合成效率。原文摘要未提供改造后酶的具体动力学参数和产量提升数据。
焦黑素合成
研究报道了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理两种焦黑素合成方式的差异。这两种方式在聚合机制、产物结构和性质上可能存在区别。原文摘要未提供两种方式产物的具体表征数据，如分子量分布、紫外-可见吸收光谱特征、热稳定性等。
高密度发酵
在5升发酵罐中，菌株Pyo29经过204小时高密度发酵，焦黑素产量达到70.5 ± 0.7 g/L。这是目前报道的焦黑素微生物合成的最高产量之一。该结果验证了工程化K. phaffii在焦黑素工业生产中的潜力。
应用价值展示
研究最后展示了焦黑素的潜在应用价值。原文摘要未详述具体应用场景和性能测试数据。从焦黑素的已知性质推断，其应用可能涉及紫外线防护、抗氧化材料或光电功能材料等领域。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于，它展示了如何通过系统的代谢工程策略，将一个天然产量极低的化合物变成可工业化生产的产品。66倍的产量提升不是单一策略的功劳，而是多拷贝整合、模块平衡、酶工程改造和发酵工艺优化协同作用的结果。
颜色筛选系统的设计尤为巧妙。它把原本需要色谱检测的繁琐过程，简化成肉眼可辨的颜色变化。这种"表型-基因型"的直接关联，大幅加速了酶改造的筛选周期。
碱性氧化聚合与漆酶处理的对比也值得关注。聚合方式直接影响焦黑素的结构和性质，进而决定其应用场景。理解这两种聚合路径的差异，有助于按需定制特定性能的焦黑素产品。
70.5 g/L的产量在微生物色素合成领域处于领先水平。但距离真正的工业应用，可能还需要解决下游纯化、产品标准化和成本控制等问题。以甲醇为碳源的优势在于原料廉价易得，且不占用粮食资源。
这项研究为其他天然产物的微生物合成提供了一个可借鉴的范式：从关键酶挖掘到多拷贝整合，从筛选系统开发到发酵工艺放大，每一步都有章可循。
参考来源
Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nature Communications. PMID: 41839868.
PMID: 41839868