来源：Front Plant Sci | 编译：DNA Lab Space
导语
当归（*Angelica sinensis*）是我国传统大宗药材，其药效物质基础主要源于挥发油中的萜类化合物，然而其生物合成途径的分子调控机制长期不明。近日，研究人员首次在当归全基因组水平系统鉴定了萜类合酶基因家族，综合运用转录组学、异源表达和酶功能鉴定等技术，解析了多个关键AsTPS基因的表达模式与催化功能。该研究不仅为当归萜类活性成分的合成生物学制造提供了核心元件，更为药用植物芳香族代谢途径的解析树立了新范式。
研究背景
当归为伞形科当归属多年生草本植物，其干燥根入药，素有“十方九归”之称。现代药理学研究表明，当归挥发油中所含的藁本内酯、β-石竹烯、α-蒎烯等多种单萜与倍半萜类化合物，具有抗炎、镇痛、神经保护及抗肿瘤等广谱生物活性。然而，当归萜类成分的含量受种质、产区和栽培年限影响极大，优质药材供给长期面临瓶颈。
萜类化合物均来源于共同的前体——异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），经法尼基焦磷酸（FPP）或香叶基焦磷酸（GPP）等中间体，由萜类合酶（terpene synthases, TPS）催化生成结构多样、功能各异的萜类骨架。TPS基因家族是萜类生物合成途径中的关键节点，其成员的数量、序列分化和表达调控直接决定了特定物种萜类化学型的形成。近年来，随着多种药用植物基因组测序的完成，TPS家族的全基因组鉴定与功能研究已成为揭示有效成分合成机制的前沿热点。然而，当归基因组资源的相对滞后，使其TPS基因的全貌及调控网络一直未被系统阐明。
针对这一空白，Xiang等人基于已发布的当归高质量染色体水平基因组，首次在全基因组范围内对AsTPS基因家族进行系统挖掘，结合转录组表达图谱分析与离体酶功能验证，揭示了参与当归活性萜类合成的候选基因及其功能特征，为后续的分子育种和代谢工程改造奠定了关键基础。
研究方法
该研究设计了一条从基因组挖掘到功能验证的完整技术路线，层层递进地解开当归TPS基因家族的功能密码。
**基因组范围鉴定与生物信息学分析**：以拟南芥和水稻等模式植物的TPS蛋白序列为饵，利用BLASTP和HMMER工具在当归基因组蛋白序列库中全面检索。候选序列进一步递交至Pfam和CDD数据库进行保守结构域验证，严格筛选具备PF01397（萜类合酶N端域）和PF03936（萜类合酶金属结合域）的成员。通过ClustalW多重序列比对和IQ-TREE构建最大似然系统发育树，明确AsTPS在TPS-a、-b、-c、-e/f、-g亚家族中的分类归属。同时，利用ExPASy、SignalP、TMHMM等在线工具进行理化性质、信号肽及跨膜结构预测，并通过MEME分析保守基序，MCScanX进行物种内与物种间共线性分析，以追溯基因扩增与演化模式。
**转录组表达谱构建**：为捕捉AsTPS基因在不同组织与发育阶段的表达动态，研究者选取成熟根、茎、叶、花以及不同生长年限的根组织，进行RNA-seq建库测序。FPKM值经标准化后绘制热图，进行层次聚类分析，重点关注在根部高表达且与挥发油积累曲线正相关的基因。此外，利用qRT-PCR对关键候选基因进行表达量验证，确保转录组数据的可靠性。
**候选基因克隆与异源表达**：根据表达分析结果，选取数个在根系中优势表达且含有完整开放阅读框的AsTPS基因。从当归根组织提取总RNA并反转录为cDNA，利用设计特异性引物克隆全长编码序列，经酶切连接构建至pET-28a或pMAL-c5X原核表达载体。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）或Rosetta菌株，优化IPTG诱导浓度、温度和时间，以实现可溶性融合蛋白的高效表达。部分蛋白进一步采用镍柱亲和层析进行纯化。
**体外酶活性测定**：以纯化的重组蛋白或粗酶提取液为催化剂，分别以GPP、FPP和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）为底物，在含Mg²⁺或Mn²⁺的缓冲体系中进行酶促反应。产物经正己烷萃取后，利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分离鉴定，通过与标准品质谱图及保留指数比对，确认产物化学结构，从而确定相应AsTPS的催化功能和产物特异性。
研究结果
该研究全面揭示了当归TPS基因家族的组成、演化、表达及功能特性，获得多项重要发现。
**AsTPS家族的全景式鉴定与分类**：在全基因组水平共鉴定出**46个AsTPS基因**，这一数量显著高于拟南芥（32个）和水稻（34个），暗示当归中萜类化学多样性的遗传基础较为厚实。系统发育分析将46个成员划入五个已知的双子叶植物TPS亚家族：TPS-a（21个）、TPS-b（14个）、TPS-c（6个）、TPS-e/f（3个）和TPS-g（2个）。其中TPS-a和TPS-b为最大的两个亚家族，分别主要参与倍半萜与单萜骨架的生物合成。保守基序分析显示，多数AsTPS蛋白含有高度保守的DDxxD和NSE/DTE催化模体，这是I类萜类合酶依赖金属离子催化环化的分子标志。
**染色体分布与基因扩增机制**：AsTPS成员不均匀地分布于11条染色体上，呈现明显的串联重复与片段重复事件。特别是9号染色体上存在一个大型TPS基因簇，包含多个TPS-a与TPS-b成员，提示该区域经历了近期的局部基因复制爆发。共线性分析还揭示当归与同为伞形科的胡萝卜、芹菜间存在保守的TPS共线性区块，说明部分祖先基因在伞形科物种分化前已经产生。
**组织特异性表达图谱**：转录组数据聚类热图清晰地展示了AsTPS基因表达的时空特异性。多数TPS-b亚家族成员在叶片和花中高度表达，与挥发油中单萜主要储存于地上组织的表型相吻合。而数个TPS-a成员（如*AsTPS03*、*AsTPS15*、*AsTPS28*）在根，尤其是三年生以上根的周皮中特异性高表达，其表达水平与藁本内酯及其他倍半萜累积趋势呈显著正相关。qRT-PCR验证结果与转录组数据高度一致，确认了这些“根特异性高表达基因”是参与活性萜类合成的核心候选。
**关键AsTPS的催化功能验证**：研究成功克隆并异源表达了6个候选AsTPS基因。体外酶活实验显示，以FPP为底物时，**AsTPS15** 主要生成β-石竹烯和少量α-蛇麻烯；**AsTPS28** 则催化合成右旋大牻牛儿烯D和δ-杜松烯，这两类化合物均为当归挥发油的特征性倍半萜成分。以GPP为底物时，**AsTPS09** 显示出柠檬烯合酶活性，产物以D-柠檬烯为主，伴有少量α-蒎烯与β-月桂烯。上述产物的质谱匹配度均超过90%，明确赋予了这些AsTPS基因具体的生化功能。值得注意的是，部分TPS在体外表现出多产物催化特性，这符合植物萜类合酶功能混杂的普遍特征，也为当归挥发性成分的复杂性提供了直接分子解释。
讨论与展望
该项系统研究首次揭开了当归萜类合酶基因家族的全貌，为药用植物功能基因组学提供了出色的范例。当归中46个AsTPS成员的发现，尤其是多个参与特征性活性萜类合成的功能基因，填补了伞形科药用植物萜类代谢关键酶信息空缺。β-石竹烯、柠檬烯等产物的鉴定，与当归挥发油化学指纹图谱相互印证，表明*AsTPS15*、*AsTPS09*等基因是决定当归道地性品质的核心功能元件。
研究进一步提示，TPS基因在不同组织中的分化表达可能是当归实现萜类物质分区合成的分子基础：叶片和花主要积累单萜以防御食草动物和吸引传粉昆虫，而根系则合成并储存倍半萜与苯酞类成分，构成药材疗效的物质基础。这种功能分化不仅具有生态适应意义，更为代谢工程改造指明了靶点方向——通过特异性地增强根部相关TPS的表达，有望定向提升药用活性成分的积累。
展望未来，该成果将在多个维度推动研究与应用的发展。首先，可进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在当归愈伤组织或毛状根体系中验证体内基因功能，构建高产挥发油成分的细胞工厂。其次，鉴于当归中复杂的苯酞类化合物（如藁本内酯）的合成尚需与细胞色素P450等后修饰酶协同，后续可整合TPS与P450共表达策略，在微生物底盘中从头合成高价值活性分子。最后，基于全基因组关联分析或景观基因组学手段，解析优良农家种中TPS等位变异的驯化选择信号，将为当归分子设计育种提供精准标记。该研究不仅是对一味千年古药的分子解密，更为药用植物活性成分的绿色制造打开了新的大门。
参考来源
Xiang H, Sui M, Wang A, Zhang J, Yao S. Genome-wide analysis and functional characterization of AsTPS genes in Chinese angelica (*Angelica sinensis*). *Frontiers in Plant Science*, 2024. DOI: 10.3389/fpls.2024.xxxxx（注：具体DOI号待论文正式发布后补充）