来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种环境友好的生物催化剂，可氧化多种有机化合物，在工业废水处理中具有广阔前景。本研究从嗜热地衣芽孢杆菌SO8菌株中，采用三相分配法（TPP）——一种简单、快速、低成本且高效的生物分离技术——纯化漆酶，并对其酶学性质及染料脱色能力进行了初步评价。在优化条件（pH 9.0、叔丁醇比例1.0:1.0、70%硫酸铵）下，漆酶纯化5.65倍，回收率达102.07%，分子量约38.7 kDa。该酶在pH 9.0和70°C下表现出最佳活性，并在宽泛的pH和温度范围内保持约65%的活性。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧化还原酶；EC 1.10.3.2）是一种含四个铜离子的多酚氧化酶。在将氧气还原为水的过程中，这些酶催化单酚、二酚和多酚、芳香族化合物、有机污染物及无机底物的氧化。由于其对多种酚类和非酚类化合物的氧化能力，漆酶是纺织、造纸木质素降解、污染物脱毒、葡萄酒澄清、有机化学合成、生物传感器及酶生物燃料电池阴极反应等领域的重要工业酶。
漆酶结构中含有约15–40%的碳水化合物（如葡萄糖、甘露糖、己糖胺和阿拉伯糖），这些碳水化合物为漆酶提供了高稳定性。漆酶单体的分子量在50–85 kDa范围内。细菌漆酶相较于真菌和植物来源的漆酶具有底物特异性更广、生产成本低且快速、最适pH范围更宽、热稳定性更强以及耐碱性条件等优势。然而，尽管细菌漆酶多样性的基因组知识不断扩展，对其具体性质的研究仍然有限。
研究方法
菌株与化学试剂
本研究使用由Olmez等人从内夫谢希尔Kozaklı温泉中分离的地衣芽孢杆菌SO8菌株（GenBank登录号：MG076978）作为漆酶来源。所用全部化学试剂和溶剂购自Merck（德国）和Sigma-Aldrich（美国）。
酶活与蛋白测定
漆酶活性采用改良自Wang等人（2014）的方法测定。简述如下：将0.5 mL酶溶液与1 mL含0.5 mM ABTS的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）在55°C下孵育15 min。对照反应使用缓冲液代替酶溶液进行。通过分光光度法在420 nm波长下监测ABTS的氧化来测定酶活性。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 µmol ABTS所需的酶量。活性计算按照Baltierra Trejo等人（2015）描述的公式进行。蛋白质浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。
漆酶的纯化
培养液中与漆酶一起存在的细菌细胞通过离心（6000 rpm，15 min，4°C）去除。所得匀浆用作TPP的酶源。在漆酶纯化中，首先为达到最高纯化效率，对硫酸铵浓度（20–80% w/v）、匀浆/叔丁醇比例（1.0:0.5、1.0:1.0、1.0:1.5、1.0:2.0 v/v）和pH（2.0–11.0）等参数进行TPP纯化优化。在TPP过程中，首先将不同浓度的硫酸铵加入2 mL匀浆中并缓慢涡旋混合，然后按不同比例加入叔丁醇并涡旋30 s。混合物在室温下孵育1 h，然后以6000 rpm离心5 min。离心后观察到三相形成，去除上相中的叔丁醇，随后立即将中间相和下相水相分别收集到不同试管中。对中间相和下相水相进行漆酶活性和总蛋白浓度分析。中间相中的蛋白质沉淀溶解在0.1 M pH 7.0磷酸钠缓冲液中。确定硫酸铵和叔丁醇比例后，将匀浆（2 mL）用70%硫酸铵饱和，并用1 M NaOH和1 M HCl调节至不同pH（pH 2.0–11.0），然后加入叔丁醇。按下相和中间相的漆酶活性和蛋白质含量如前所述进行测定。绘制表示活性回收率（%）相对于纯化倍数的图表。
SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，以确定通过TPP方法部分纯化的漆酶的纯度和分子量。电泳过程使用12%（w/v）分离胶和4%（w/v）浓缩胶，基于Laemmli（1970）方法进行。每孔上样20微升样品。凝胶电泳过程首先在250 V下运行5–10 min以确保浓缩阶段，然后在120 V下约90 min使蛋白质在分离胶中分离。蛋白质条带通过银染20 min显色。蛋白质分子量标记物（ECOTECH）用作标准品。
纯化漆酶的酶学表征
pH和温度的影响
为确定纯化漆酶的最适pH，在0.1 M缓冲液中进行酶活性测定，pH范围为2至12。所用缓冲液包括甘氨酸-HCl（pH 2.0–3.0）、乙酸钠（pH 4.0–5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris-HCl（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH（pH 10.0–11.0）。为确定纯化漆酶的最适温度，在20至90°C范围内进行酶活性测定。显示最高活性的pH和温度值设为100%用于相对活性计算。为评价pH稳定性，将0.5 mL漆酶在不同pH值的缓冲液中于指定范围内孵育2 h。然后测定残余活性，初始活性设为100%。热稳定性通过在20°C至90°C温度范围内将酶孵育30、60、90和120 min来评估。在最佳pH（pH 5.0）下使用1.5 mL缓冲液、1 mL底物和0.5 mL酶溶液测定残余活性。初始活性视为100%用于相对活性计算。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
为研究某些金属离子对漆酶的影响，使用20 mM（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）金属离子溶液，将0.5 mL纯化漆酶加入每种金属离子中使最终浓度为1、5和10 mM，孵育30 min，然后测定剩余漆酶活性。以不含任何金属盐的酶活性作为100%对照。类似地，研究不同表面活性剂和抑制剂对漆酶的影响：Triton X-100、Tween-20、Tween-80浓度为1%、5%和10%，SDS浓度为5、10和20 mM，以及NaF和EDTA。孵育结束后，以初始活性为100%测定漆酶的残余活性。
底物特异性
使用各种酚类（愈创木酚、鞣酸和L-酪氨酸）和非酚类（ABTS）底物测定从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的底物特异性。ABTS底物溶液在100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）中制备，愈创木酚和鞣酸在50 mM Tris-HCl（pH 7.0）中制备，L-酪氨酸在50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液中制备。漆酶活性最高的底物的活性设为100，计算其他底物的相对活性（%）。
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测定了ABTS底物在50–1000 µM范围内不同浓度下的活性。用所得值绘制Lineweaver-Burk图，利用该图计算Km、Vmax、Kcat和催化效率（Kcat/Km）。
染料脱色
反应混合物由0.5 mL染料溶液、0.5 mL漆酶和1 mL 0.5 mM ABTS介体溶液组成。然后将该混合物在55°C下分别孵育15、30、60和120 min，每次孵育在不同初始pH值（5.0、7.0和9.0）下进行。孵育结束时的剩余染料浓度在最佳波长下用分光光度法分析。染料脱色百分比如下式计算：脱色率(%) = [(Ci − Ct)/Ci] × 100。其中Ci为染料初始浓度，Ct为剩余染料浓度。
统计分析
所有涉及从地衣芽孢杆菌SO8分离的漆酶的实验均进行三次重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示，代表三次独立实验的平均值和变异性。漆酶表征数据的统计分析使用GraphPad Prism®软件（版本9.0，GraphPad Software，San Diego，CA）进行Student双尾t检验。
研究结果
酶的分离与纯化
为获得耐受极端条件的漆酶，选择了本实验室先前分离和鉴定的耐热细菌中活性最高的地衣芽孢杆菌SO8菌株。采用TPP——一种简单、快速、一步式生物分离技术——作为昂贵的、耗时的、多步骤传统方法的替代方案，从细菌液体培养物中纯化漆酶。首先，为以最高产率通过TPP方法纯化从地衣芽孢杆菌SO8菌株分离的漆酶，对叔丁醇、硫酸铵、pH和比例等参数进行了优化。优化纯化条件对于实现高酶纯度和产率至关重要。
图1显示了各种参数对匀浆中漆酶纯化系数和产率的影响。最佳条件确定为70%（w/v）硫酸铵浓度、1.0:1.0匀浆液：叔丁醇比例和pH 9.0，实现了5.65倍纯化和102.07%的产率。
表1总结了使用TPP对SO8漆酶的整体纯化情况。在优化条件下，TPP有效地从地衣芽孢杆菌SO8粗提物中纯化了漆酶，实现了102.07%的产率和5.65倍纯化。叔丁醇浓度的增加导致有机相中水吸收增加，提高水相盐度，从而在界面处产生蛋白质沉淀。漆酶在TPP过程中通常分配至界面相。产率超过100%是TPP方法在纯化过程中去除抑制剂和激活酶的能力的结果。此外，TPP过程中使用的硫酸铵和叔丁醇的联合效应可引起酶三维构象的积极变化，使其转变为更活跃的结构。
表1 从B. licheniformis SO8纯化漆酶的纯化表
| 纯化步骤 | 总活性 (EU/mL) | 总蛋白 (mg/mL) | 比活 (EU/mg) | 回收率 % | 纯化倍数 |
|---------|---------------|----------------|-------------|----------|---------|
| 粗提物 | 72.446 | 0.520 | 139.32 | 100 | 1 |
| TPP-界面相 | 73.948 | 0.094 | 786.68 | 102.07 | 5.65 |
| TPP–水相 | 31.08 | 0.256 | 121.4 | 42.9 | 0.87 |
先前研究已证明TPP适用于漆酶的高产率纯化。例如，一项研究报告了来自糙皮侧耳漆酶的27.8倍纯化和161%产率。Rajeeva和Lele（2011）使用两阶段TPP对灵芝属漆酶实现了60%的产率和13.1倍纯度。Liu等人报道了通过TPP纯化的漆酶达到20倍纯度和约75%产率。与常用的其他方法相比——如硫酸铵沉淀-固定化金属亲和色谱法（糙皮侧耳漆酶46倍纯化，57.4%产率）、渗滤法（灵芝属漆酶3.7倍纯化，90.4%产率）和超滤法（Pycnoporus属漆酶2.14倍纯化，87%产率）——TPP通常表现出更优异的纯化产率。TPP是一种新兴的蛋白质沉淀生物分离技术，能够实现高效酶纯化和回收。与传统色谱方法相比，TPP在蛋白酶和淀粉酶等酶的更高纯度方面显示出潜力。TPP因其多功能性日益受到认可，现广泛用于各工业部门的蛋白质回收。
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析证实了TPP对漆酶纯化的有效性。与粗酶提取物（泳道a）和水相（泳道b）相比，仅在界面相（泳道c）观察到单一蛋白质条带。这一观察强烈表明TPP有效去除了污染蛋白和其他分子，使目标漆酶富集于界面相。基于SDS-PAGE分析，纯化的地衣芽孢杆菌SO8漆酶的分子量约为38.7 kDa。该分子量落在其他细菌物种漆酶的报道范围内，如B. tequilensis SN4漆酶32 kDa，Enterococcus faecium A2漆酶50.11 kDa，以及Arthrobacter gonensis P39漆酶160 kDa。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的最适pH确定为9.0，表明其为碱性酶。漆酶在宽pH范围（pH 2.0–11.0）内保持超过50%的活性。从SO8菌株分离的漆酶在高pH值下保持稳定，在所有pH值下120 min结束时保持超过35%的活性。在高pH值下表现活性并保持稳定的漆酶在工业上需求很高。虽然在60 min时观察到相对活性下降，但在120 min时相对活性的恢复和增加表明酶对极端条件的抵抗力，代表了初始环境胁迫后的结构恢复和激活过程。来自链霉菌和Thioalkalivibrio的耐碱漆酶大多起源于芽孢杆菌属物种。
为确定地衣芽孢杆菌SO8漆酶的温度曲线和稳定性，在20°C至90°C之间的温度下进行研究，结果显示在70°C时具有最大活性，在20–90°C范围内具有高活性。漆酶的活性测量在20°C至90°C之间的温度下进行，周期间隔为120 min。观察到漆酶在所有研究温度下2 h孵育期间显著保持其活性。漆酶的高耐热性是其进化适应的结果，这得益于其含有的密集碳水化合物基团、强二级结构键，尤其是其细菌起源。酶在这些温度范围内长时间不失活很重要，因为纺织厂的废水可能处于高温状态。冷却水既需要时间又需要资源。
先前研究已证明来自不同来源的漆酶存在显著的热不稳定性。例如，Koschorreck等人（2008）报道真菌漆酶在70°C下2 h后活性损失92%，而Halaburgi等人（2011）观察到C. cladosporioides漆酶在80°C下5 min内活性损失52%。相比之下，地衣芽孢杆菌SO8漆酶表现出卓越的热稳定性。这种显著的稳定性表明其具有高温耐受性和宽操作温度范围。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
研究了各种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶活性的影响。在1和5 mM浓度的Fe²⁺和Mn²⁺离子存在下，漆酶活性增加。在其他金属离子存在下，酶活性……（原文截断）
表2 一些表面活性剂和抑制剂的影响
| 处理 | 浓度 | 残余活性 (%) |
|------|------|-------------|
| 对照 | - | 100 |
| 表面活性剂 (% v/v) | | |
| Triton X-100 | 1 | 82.26 ± 2.65 |
| | 5 | 41.72 ± 5.85 |
| | 10 | 19.92 ± 0.489 |
| Tween-20 | 1 | 100.3 ± 1.49 |
| | 5 | 98.39 ± 7.15 |
| | 10 | 40.79 ± 0.233 |
| Tween-80 | 1 | 119.9 ± 18.87 |
| | 5 | 103.2 ± 11.36 |
| | 10 | 41.72 ± 3.527 |
| 抑制剂 (mM) | | |
| SDS | 5 | 100.8 ± 3.604 |
| | 10 | 92.83 ± 4.404 |
| | 20 | 58.97 ± 8.414 |
| NaF | 5 | 90.54 ± 3.871 |
| | 10 | 79.93 ± 0.998 |
| | 20 | 60.61 ± 8.159 |
| EDTA | 5 | 114.1 ± 13.40 |
| | 10 | 82.97 ± 1.710 |
| | 20 | 49.65 ± 1.456 |
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测定了ABTS底物在50–1000 µM范围内不同浓度下的活性。通过Lineweaver-Burk图计算得出：Km为110 µM，Vmax为19.6 µmol L⁻¹ min⁻¹，kcat为0.048 s⁻¹，kcat/Km为0.44 s⁻¹ mM⁻¹。
染料脱色
在pH 5、7和9三种初始pH条件下，对六种不同染料进行了120 min的脱色实验。结果显示脱色效率中等，其中酸性红27（Acid Red 27）的脱色率最高，达到38%。这表明在优化条件下，该嗜热漆酶可作为染料处理的潜在生物催化剂。
讨论与解读
本研究成功采用三相分配法（TPP）实现了地衣芽孢杆菌SO8漆酶的一步纯化。TPP被证明是一种快速、经济且高效的替代方案，实现了5.65倍纯化和102%的产率。纯化的漆酶在宽pH范围（2.0–11.0）和温度范围（20–90°C）内表现出显著的稳定性。值得注意的是，它在高温下保持了92%的活性，超过了文献中报道的许多细菌漆酶的热稳定性。此外，该酶对多种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）、化学物质/抑制剂（NaF和EDTA）和表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-80）表现出显著的耐受性。这种稳健的稳定性，加上其广泛的活性谱和脱色潜力，使地衣芽孢杆菌SO8漆酶成为多种工业应用（特别是生物修复）的有前景的候选者。
编译者解读
该研究展示了TPP技术在细菌漆酶纯化中的独特优势——一步操作即实现5.65倍纯化且产率超过100%，这得益于TPP同时去除抑制剂和激活酶构象的双重效应。从合成生物学应用角度看，38.7 kDa的分子量低于典型真菌漆酶（50–85 kDa），加之70°C最适温度和宽pH耐受性，使其在高温工业废水处理场景中具有实际部署潜力。然而，染料脱色率最高仅38%，提示该酶在实际应用中可能需要通过定向进化或介体系统优化来提升催化效率。TPP的简便性和可放大性也为工业规模酶纯化提供了成本优势。
参考来源
Yıldırgan S, Aygün E, Altintas R, Şişecioğlu M. Purification of laccase from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 with three-phase partitioning, characterization, and usage in dye decolorization. 3 Biotech. PMID: 42179929.
PMID: 42179929