大麦赤霉病多组学解析：芳香族氨基酸来源防御化合物的诱导合成

来源：Stress Biol | 编译：DNA Lab Space

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导读

赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）是危害大麦、小麦等小粒谷物的毁灭性真菌病害，每年造成全球范围的产量与品质损失。本研究整合转录组、蛋白质组与代谢组三种非靶向组学手段，系统解析大麦穗部应对禾谷镰刀菌（Fusarium culmorum）侵染的防御反应。研究发现，不同抗性水平的大麦品种在转录、蛋白与代谢物三个层面均一致上调芳香族氨基酸来源的次生代谢通路，包括色氨酸衍生的应激代谢物及大麦特有的羟基肉桂酰胺类化合物。570个基因-蛋白共调控对为解析大麦II型抗性机制提供了候选靶点。

研究背景

赤霉病由镰刀菌属真菌引起，欧洲小麦和大麦上的主要病原为禾谷镰刀菌（F. graminearum）和黄色镰刀菌（F. culmorum）。该土传病原菌在大麦扬花中期通过开放花朵侵入寄主，先经历约48小时的活体营养阶段，随后转为死体营养生长，导致穗部褐变枯萎。镰刀菌产生多种真菌毒素，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）通过结合真核核糖体肽酰转移酶中心抑制蛋白质生物合成，对人畜均有毒性。与大麦相比，小麦缺乏天然抗性；大麦则表现出天然的II型抗性，可阻止菌丝通过穗轴蔓延。此前研究多聚焦转录水平的防御反应，但转录变化在多大程度上转化为蛋白质与代谢物水平的功能改变仍不清楚。本研究通过多组学整合策略，从同一植物材料中同时获取基因表达、蛋白丰度与代谢物数据，以识别在所有分子层面一致上调的防御通路。

研究方法

感染实验

温室实验包含四个赤霉病敏感性不同的大麦基因型：Barke、Avalon、Morex和Palmella Blue。植株在慕尼黑工业大学植物技术中心的温室隔间中，于淹没式台面上受控条件下生长。使用3升花盆装泥炭基质（Einheitserde C700, Stender, Germany），每盆播种5粒种子，昼/夜温度为18/16°C，每日补充光照16小时，相对空气湿度60%。

人工接种使用来自慕尼黑工业大学植物病理学系真菌保藏中心的三个F. culmorum菌株Fc002、Fc03和Fc06。真菌在马铃薯葡萄糖琼脂上于21°C、60%相对湿度、12小时UV加白光与黑暗交替条件下培养。接种用孢子液以无菌自来水配制，含1 ml/l Tween 80®，孢子浓度调至50,000分生孢子/ml，三个菌株各占等量。Mock处理为含1 ml/l Tween 80的无菌自来水。

大麦穗在盛花期（GS 65）前后喷洒F. culmorum孢子液或Mock液至滴落，随后用塑料袋包裹密封2天以保证99%相对空气湿度。接种后4天和7天取样，立即于液氮中冷冻。每个品种、处理和时间点采集4个生物学重复，每个重复由3个穗混合而成。

DNA提取

穗组织在液氮中研磨，取150 mg样品按Fraaije等（1999）方法并参照Hofer等（2016）的修改方案提取基因组DNA。

真菌DNA定量

利用种特异性引物靶向延伸因子1α（EF1α）基因，通过qPCR测定未成熟穗组织中真菌DNA与大麦基因组DNA的相对含量。F. culmorum引物：FculC561正向 CACCGTCATTGGTATGTTGTCACT；Fcul614反向 CGGGAGCGTCTGATAGTCG。大麦（Hordeum vulgare）引物：Hor1正向 TCTCTGGGTTTGAGGGTGAC；Hor2反向 GGCCCTTGTACCAGTCAAGGT。以靶标DNA的十倍梯度稀释系列作为标准品。测量使用Takyon Low ROX SYBR 2X MasterMix Blue dTTP（Eurogentec, Belgium）在AriaMx实时PCR系统（Agilent Technologies）上进行，每个样品两个技术重复。

RNA提取

穗材料在液氮中研磨，取100 mg样品使用GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit（EURx Molecular Biology Products）按制造商说明书提取总RNA。

3’-RNA测序

使用QuantSeq 3’mRNA-Seq Library Prep Kit（Lexogen, Austria）按制造商说明书制备3’-RNA测序文库。文库大小用Qubit Fluorometer 2.0和Qubit DNA High Sensitivity Assay Kit定量，cDNA文库混合池通过qPCR确定。使用Agilent 2010 Electrophoresis Bioanalyzer配High Sensitivity DNA Assay检查每个文库的完整性和mRNA片段大小分布。下一代测序在Illumina NovaSeq 6000系统上进行。

3’RNAseq读段质控、比对与注释

获得的3’RNAseq读段使用nf-core/rnaseq（v3.17.0）配合Nextflow（v24.04.4）处理。比对使用已发表的Morex V3参考基因组（Mascher et al. 2021）与F. culmorum基因组FusCulm_01（GenBank提交号GCA_003033665.1）合并作为参考，最后一个外显子的3’-UTR区域延伸3 kb或延伸至下一个基因。读段比对使用STAR（v2.11.1b），转录本定量使用Salmon（v1.10.3），原始读段质控使用FastQC（v0.12.1），接头修剪和过滤使用Trim Galore（v0.6.10）配合Cutadapt（v4.9）。原始读段和比对数据已提交GEO，项目编号GSE310570。

差异基因表达分析

差异基因表达分析使用edgeR包版本4.0.16。比对上镰刀菌基因的读段从后续分析中排除。低表达基因通过保留至少4个样品中CPM > 10的基因进行过滤。数据集随后通过calcNormFactors()进行TMM标准化。使用model.matrix()构建设计矩阵以定义样品分组。使用estimateDisp()进行稳健离散度估计。使用glmFit()拟合广义线性模型（GLM），并通过makeContrasts(genotype_infected_4dpi – genotype_mock_4dpi; genotype_infected_7dpi – genotype_mock_7dpi)定义条件与基因型之间的特定对比，以实现差异表达分析。

蛋白质提取与样品制备

取500 mg各样品，使用三氯乙酸/丙酮沉淀后进行酚提取法提取蛋白质。蛋白质通过二喹啉甲酸测定法（BCA, Thermo Pierce）定量。200 µg蛋白质裂解液在Bravo Agilent移液系统上使用Sera-Mag™ Carboxylate-Modified Magnetic Beads（Cytiva Europe GmbH, Freiburg im Breisgau, Germany）进行蛋白聚集捕获后胰蛋白酶消化。

定量蛋白质组学测量中，样品分为8个批次，每批包含一个基因型在接种后4天或7天的样品。每批含8个样品和1个以混合样品作为批间校准器的Reference通道。消化肽段使用每样品0.1 mg TMT10plex™ Isobaric Mass Tag Labeling Reagent（Thermo Scientific™）标记，并按批次设计合并。标记合并后的样品使用C18 Sep-Pak小柱（37–55 µm粒径，50 mg容量，Waters）脱盐，洗涤步骤使用0.1%甲酸。肽段用含0.1%甲酸的60%乙腈洗脱。洗脱肽段冻干后于−20°C保存。

离线碱性反相分级

肽段的碱性反相（bRP）分级按Höfer等（2025）描述的方法进行。干燥肽段溶于200 µl 25 mM碳酸氢铵（pH 8.0）。使用Vanquish HPLC（Thermo Scientific）进行分级。样品注入Waters BEH130 XBridge C18柱（3.5 µm, 4.6 × 250 mm）。肽段在恒定存在2.5 mM碳酸氢铵（pH 8.0）条件下，以1000 µl/min流速、60分钟梯度从7%到45%乙腈洗脱。进样后7至55分钟间用自动馏分收集器收集馏分。所得96个馏分用1%甲酸酸化后合并为48个馏分，冻干并于−20°C保存。

LC–MS/MS测量

全蛋白质组TMT肽段使用与Vanquish Neo（Thermo Scientific）偶联的Eclipse Tribrid质谱仪（Thermo Scientific）测量。样品直接注入Acclaim PepMap 100 C18柱（2 µm粒径，1 mm内径×150 mm）。分离采用27分钟分段梯度，流速50 µl/min，从4% B到27% B（23分钟），27% B到32% B（2分钟）。系统最终以100 µl 90% B洗涤并在1% B下再平衡。溶剂A为含0.1%甲酸和3% DMSO的水溶液，溶剂B为含0.1%甲酸和3% DMSO的乙腈溶液。质谱仪以快速数据依赖性MS3模式运行。喷雾电压3.5 kV，辅助鞘气（32单位）和辅助气（5单位），蒸发器温度125°C。每1.2秒进行一次全扫描。

研究结果

禾谷镰刀菌侵染大麦中转录本与蛋白质的比较

为鉴定大麦防御F. culmorum的代谢通路，本研究检测了侵染后大麦穗组织的基因表达、蛋白丰度与代谢物变化。四个大麦基因型——Avalon、Barke、Morex和Palmella Blue——在受控温室条件下种植。这些品种共享II型FHB抗性（阻止真菌通过穗轴蔓延），但I型抗性（对初始小穗侵染的抗性）水平不同。Avalon（Av）和Barke（Ba）抗性较强，Palmella Blue（Pb）较感病，Morex（Mo）中度感病。扬花中期，穗部用F. culmorum孢子液或水（Mock处理）处理。接种后4天和7天分别取样。

通过qPCR定量真菌DNA与大麦DNA的相对含量来评估病害严重度和侵染成功率。真菌DNA含量随取样时间点推移而增加，且在不同大麦品种间存在差异。Avalon和Barke表现出相近的低侵染水平，接种后7天真菌DNA含量分别为4.39和5.56 pg Fcul DNA/ng Hv DNA。Morex同期含量较高，为9.63 pg Fcul DNA/ng Hv DNA，Palmella Blue的真菌DNA含量最高（22.38 pg Fcul DNA/ng Hv DNA）（表1）。真菌DNA载量反映了这些品种定量抗性的已知差异。但需注意，由于开花时间不同，并非所有品种能同时接种，而是分两批进行——Avalon和Barke为第一批，Morex和Palmella Blue为第二批。因此四个品种间的可比性部分受限，尽管数据反映了基因型典型的病害进程。

表1 四个品种接种F. culmorum孢子液后4天和7天（dpi）大麦穗组织真菌DNA含量的qPCR检测结果（pg Fcul DNA/ng Hv DNA ± SD）

| 时间点 | Avalon | Barke | Morex | Palmella Blue |

|--------|--------|--------|--------|--------------|

| 4 dpi | 2.04 ± 1.15 | 2.39 ± 1.01 | 0.95 ± 0.60 | 1.23 ± 1.26 |

| 7 dpi | 4.39 ± 1.29 | 5.56 ± 1.58 | 9.63 ± 5.06 | 22.38 ± 10.32 |

为分析F. culmorum侵染后大麦穗组织的基因表达变化，研究进行了3’-RNA测序。RNA读段比对至Morex-V3参考基因组，四个品种共检测到36,920个基因模型的RNA转录本。将侵染样品的读段计数与相应基因型和时间点的Mock处理样品比较，以寻找差异表达基因（DEGs）。至少一个比较中FDR校正P值<0.05的基因被视为DEG。数据集共获得3085个DEGs。其中1205个DEGs在非靶向蛋白质组学分析中检测到对应肽段。四个品种的DEG数量不同——Avalon、Palmella Blue和Barke各有约1700个DEGs，而Morex有942个基因转录本在侵染后差异表达。四个品种共享685个DEGs。

为分析侵染后蛋白丰度变化，研究采用非靶向bottom-up蛋白质组学方法，包括Tandem Mass-Tag（TMT）标记实现蛋白质相对定量。肽段图谱和蛋白质鉴定在MaxQuant中基于Morex v3基因组蛋白预测完成。共生成6885个定量蛋白组，包含7671个蛋白质。将侵染与Mock处理样品间的标准化相对丰度进行比较，计算蛋白丰度变化倍数。至少一个比较中p值<0.05的蛋白被视为差异丰度蛋白（DEPs）。数据集包含2813个DEP组，含3169个蛋白质，其中1405个为Palmella Blue特有，Avalon和Barke分别有591个和345个特有DEPs。四个基因型共享83个DEPs。在所有定量蛋白和比较中，色氨酸脱羧酶在F. culmorum侵染后通常表现出最高的丰度增加。其他强烈上调的蛋白包括病程相关蛋白、糖基转移酶和谷胱甘肽-S-转移酶，这些均与植物对镰刀菌和DON的防御反应相关。

转录组与蛋白质组数据集的重叠包含7149个基因/蛋白对，在这些对中同时鉴定了转录本并定量了对应蛋白。为找到最可靠参与防御反应的基因和蛋白，研究定义了570个DEG/DEP基因-蛋白对——这些对在转录和蛋白水平均显示显著调控。

养草酸途径

养草酸途径为芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的生物合成提供前体。在570个DEG/DEP对中，该途径的多个酶在转录和蛋白水平均显示差异调控。3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHPS）、3-脱氢奎尼酸合成酶（DHQS）、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）等酶在侵染后均显著上调。热图显示这些基因的转录本和蛋白在4 dpi和7 dpi的log₂(变化倍数)值，表明养草酸途径在F. culmorum侵染后被系统性激活。

色氨酸与褪黑素生物合成途径

色氨酸生物合成途径中的多个酶——包括邻氨基苯甲酸合酶（AS）、色氨酸合酶α亚基（TSA）和色氨酸合酶β亚基（TSB）——在DEG/DEP对中显著富集。色氨酸脱羧酶（TDC）在所有比较中表现出最高的蛋白丰度增加。色氨酸途径下游，褪黑素生物合成的关键酶也显示上调。代谢组数据显示，色氨酸衍生的应激代谢物如色胺和血清素在侵染后显著积累。含色氨酸来源的羟基肉桂酸酰胺（HCAAs）的丰度在侵染样品中大幅升高。

苯丙氨酸、单木质醇与禾草碱生物合成途径

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）等苯丙氨酸途径酶在570个DEG/DEP对中显著富集。单木质醇生物合成途径的多个酶——包括肉桂醇脱氢酶（CAD）和咖啡酰-CoA O-甲基转移酶（CCoAOMT）——在转录和蛋白水平均上调。大麦特有的禾草碱（hordatine）生物合成途径的酶也显示差异调控。代谢物分析显示，含胍丁胺的HCAAs和色氨酸来源的HCAAs在侵染后显著积累，这些化合物被认为是大麦防御反应的重要化学屏障。

讨论与解读

本研究整合三种非靶向组学手段，深入解析了大麦对半活体营养型病原菌F. culmorum的防御反应。单一组学研究可能无法呈现病原防御通路的全貌，或存在方法学偏差。相比之下，从同一植物材料中比较基因表达、蛋白丰度和代谢物水平，能够识别在所有分子层面一致上调的通路。尽管四个大麦品种的基础FHB抗性不同，但它们共享大麦典型的II型抗性——阻止真菌通过穗轴蔓延。因此推测，共同上调的通路可能有助于大麦对FHB的II型抗性。

F. culmorum侵染导致大麦基因调控和蛋白质组重塑。在4 dpi和/或7 dpi时，至少一个品种中鉴定出36,920个基因转录本，其中3085个为DEGs；同时定量了7671个大麦蛋白，其中3169个在FHB侵染期间显示显著差异丰度。通过定义570个DEG/DEP基因-蛋白对，研究聚焦于一致调控的病原响应通路。整合分析揭示，芳香族氨基酸来源的次生代谢上调是大麦对FHB侵染最一致的响应，这一发现在不同大麦品种中均成立。

编译者解读

本研究的方法学亮点在于将转录组、蛋白质组与代谢组数据严格对应到同一批植物材料，避免了跨批次样品的生物学噪音。570个DEG/DEP共调控对的筛选策略值得借鉴——它有效过滤了单一组学层面的假阳性信号。从合成生物学应用角度看，色氨酸脱羧酶和羟基肉桂酰胺生物合成通路中的关键酶（如HvUGT13248、HvFROG）可作为抗性改良的候选靶基因。不过，研究仅覆盖两个时间点（4和7 dpi），对防御反应的动态时序刻画有限；且温室条件下喷雾接种与田间自然侵染的差异仍需后续验证。大麦品种间DEG数量差异较大（Morex仅942个），品种特异性响应与共享核心响应的生物学意义值得进一步挖掘。

PMID: 42223798