来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷骨架的高价值活性天然产物，但在栽培人参中并不天然存在。本研究组装了东北刺人参（Oplopanax elatus）染色体级基因组，发现其通过祖先多功能三萜合酶的复制与新功能化，演化出专一性的达玛二烯醇合酶OeOSC14。单个N260Y氨基酸替换即可使该酶恢复为多功能三萜合酶。研究还揭示了C12羟化酶功能缺失阻断了RK型人参皂苷合成的下游氧化步骤，并最终在烟草中重构了Rk1、Rk2和Rk3的从头生物合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类以C30骨架为核心、经糖基修饰形成的重要次生代谢物，已报道超过20,000种结构。它们在生态防御、根系微生物组塑造及人类药理学活性（免疫调节、抗炎、抗癌等）方面发挥重要作用。人参属植物含有数百种结构各异的人参皂苷单体，主要基于达玛烷骨架并在C-3、C-6和/或C-20位发生糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，疏水性增强。与新鲜人参组织中大量存在的主要皂苷不同，RK型皂苷在栽培人参中基本缺失，通常通过热加工或酸处理（如红参加工蒸制）获得。东北刺人参作为人参近缘种，能积累RK型皂苷的前体骨架达玛二烯醇，但不产生RK型皂苷，为研究该类化合物的生物合成与进化提供了独特材料。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。该种群种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘以保持根系完整，快速清洗后立即用液氮冷冻，保存于−80 °C备用。各组织类型的形态特征见图1B。采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。PacBio HiFi长读长测序中，共使用15 µg高分子量DNA，经gTUBE剪切后，使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准SMRTbell文库。文库经BluePippin系统以15 kb截断值进行大小选择以去除短DNA片段。HiFi共有序列在PacBio Sequel II平台上生成。按标准Illumina文库构建流程操作后，Hi-C文库在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量评估
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读数结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤以获得高质量clean reads（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读数使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并整合Hi-C数据辅助组装。为将contigs锚定到染色体，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）进行Hi-C数据的过滤、排序和定向。最后，使用Juicebox v.1.11.08进行人工校正，修正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，获得高质量的染色体级基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
采用从头预测与同源比对相结合的策略鉴定东北刺人参基因组中的重复序列。首先，使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后使用RepeatMasker结合从头预测的重复数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外，使用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组内的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq的转录组预测。同源预测中，近缘物种蛋白序列使用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）比对至组装基因组，最佳比对结果及对应基因结构使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定。从头预测中，首先使用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，利用同源预测的基因结构训练HMM模型，随后使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测中，RNA-seq数据先使用HISAT2 v.2.2.1比对至基因组，比对读数使用StringTie v.2.2.0组装为转录本。剪接位点经PASA_lite v.0.1.0验证并进一步优化转录本模型。最终，三种方法预测的基因模型使用MAKER2整合为高质量基因集。功能注释方面，预测基因的蛋白序列使用BLASTP（E值<1e-10）比对SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP命中结果分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涵盖东北刺人参及18种其他植物：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。基因家族使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类。系统发育推断基于单拷贝基因家族提取的四重简并（4D）位点，使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然系统发育树（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000，1000次bootstrap重复）。单拷贝直系同源基因的四重简并位点进一步用于MCMCTree程序（PAML v4.9j包）估算物种分化时间。分歧时间在贝叶斯框架下采用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库的分歧时间。基因家族扩张与收缩使用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
种内旁系同源基因对方面，使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，区块内基因对的Ks值使用PAML中的codeml在F3X4模型下计算。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排序选择最佳命中基因对，使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）及PTHR48047（UGT），使用HMMER v.3.1b2在东北刺人参中进行，E值阈值为<0.01。预测蛋白序列使用SeqKit v.2.6.1按长度过滤：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员使用在线工具Conserved Domain Database验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，我们使用植物中已报道功能的基因序列连同东北刺人参的预测家族成员进行系统发育分析。所有序列见补充数据3–6。多序列比对使用MAFFT v.7.518以默认参数进行。最大似然系统发育树使用FastTree v.2.2软件在默认设置下构建。Newick格式的树文件使用iTOL在线平台可视化和注释。
植物基因表达载体构建
总RNA使用EasyPure® Plant RNA Kit提取（原文未详述具体步骤）。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，先前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参三萜骨架的多样性和组织特异性分布，我们对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎片模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物在m/z 189的总离子色谱图和提取离子色谱图中显示出一个在37.15 min出峰的显著未知产物峰（P1），其强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法据此进行结构鉴定（图1D）。因此，我们对叶片中的P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振波谱确定其结构为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。随后，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，我们使用Rk1、Rk2和Rk3的商业化标准品进行了靶向LC–MS分析。这三种人参皂苷在东北刺人参的叶片或任何其他检测组织中均未检出（图1E-G和补充图9）。综合来看，这些结果表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，我们生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体级基因组组装。东北刺人参的单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率为8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读数和126.91 Gb（约71×）Hi-C读数用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含两个单倍型，锚定至24条假染色体，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整度为99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，并预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，我们分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。基于145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个强支持的分支：一支包含刺五加和东北刺人参，另一支包含辽东楤木及5个人参属物种。该拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的A和B亚基因组分别形成两个独立分支，分别与东北刺人参的A和B亚基因组聚类，这与两者共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源一致。在异源四倍体人参属物种中也观察到类似的双亚基因组模式，其中B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）显示出更高的相似性，表明B亚基因组可能源自一个二倍体五加科样祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群的MCMCTREE分歧时间估计（使用TimeTree的化石校准）将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，两个主要五加科谱系的后续分离约在28.5百万年前。重要的是，东北刺人参的A和B亚基因组约在23.2百万年前分化，早于辽东楤木–人参属分支内的物种分化（图2B）。随后我们比较了候选植物物种的基因组，以获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度表达，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。我们因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与Vitis vinifera之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种在约0.1处表现出额外的Ks峰，而二倍体物种中不存在该峰。每个异源四倍体两个亚基因组之间的直系同源基因对也在约0.1处显示峰。与该模式一致，共线性分析揭示了V. vinifera、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在共享WGD之后发生的相对较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，我们假设东北刺人参基因组编码一种特异性催化2,3-氧化角鲨烯环化形成达玛二烯醇的氧化角鲨烯环化酶（OSC）。为验证该假设，我们使用已知人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行了BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
RK型人参皂苷生物合成途径的解析与重构
为阐明东北刺人参中RK型人参皂苷生物合成缺失的分子机制，我们对参与达玛烷型皂苷C-12羟化修饰的CYP基因家族进行了系统发育分析，并在东北刺人参基因组中鉴定了C12羟化酶基因座的共线性关系。结果显示，东北刺人参中C12羟化酶功能缺失，阻断了RK型人参皂苷生物合成所需的下游氧化步骤（图6）。
基于上述发现，我们在本氏烟草中重构了RK型人参皂苷的异源生物合成途径。将OeOSC14与PgCYP716A47、PgCYP716A53v2共表达后，GC–MS分析检测到相应的产物峰（图7A）。进一步共表达UGT基因后，LC–MS分析检测到人参皂苷Rk3（m/z 665.430）、Rk2（m/z 649.435）和Rk1（m/z 811.488）的产物峰（图7B、C）。MS碎裂谱证实了产物身份（图7D）。定量分析显示，Rk1、Rk2和Rk3在烟草中实现了从头生物合成（图7E）。
讨论与解读
本研究通过染色体级基因组组装、比较基因组学和生化分析，揭示了东北刺人参中达玛二烯醇合酶OeOSC14的进化机制——该酶由祖先多功能三萜合酶经复制和新功能化演化而来。单个N260Y氨基酸替换即可使OeOSC14从达玛二烯醇特异性酶恢复为多功能三萜合酶，这一发现为三萜合酶的功能分化提供了精确的分子证据。研究还阐明了东北刺人参虽积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷的原因——C12羟化酶功能缺失阻断了关键氧化步骤。最终在烟草中成功重构Rk1、Rk2和Rk3的从头生物合成，为这些高价值化合物的可持续生产提供了植物-based平台。
编译者解读
该研究展示了一条从基因组挖掘到途径重构的完整合成生物学工作流。亮点在于将进化基因组学与生化功能验证紧密结合——通过比较基因组学锁定关键基因，用单氨基酸突变验证功能转变，再以异源重构验证整个途径的可行性。N260Y替换的发现为三萜合酶的理性设计提供了精准靶点。值得注意的是，该研究选择烟草作为异源宿主，避免了在人参中进行遗传操作的困难，体现了植物合成生物学的策略智慧。局限在于异源重构的产量仍有提升空间，未来可通过启动子优化、代谢流量调控等手段进一步提高RK型皂苷的产量。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nat Commun. PMID: 42342661.
PMID: 42342661