来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，启发科学家构建多酶级联以生产复杂分子。然而，酶不相容性、底物传递差和催化剂回收难等问题长期制约实际应用。本研究报道了一种基于Pickering乳液的生活细胞生物催化平台，通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳液。该平台实现化学酶和酶级联反应加速，反应速率较传统双相体系最高提升45倍，支持单步、顺序和一步级联反应，包括克级苯偶姻合成，并实现按需双模式回收。
研究背景
自然界中的酶级联反应是化学制造的巅峰，能将简单前体转化为复杂高价值分子，兼具无与伦比的精确性和效率。这种生物装配线通过在特定细胞微环境中组织多种酶，克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等挑战。将这一概念转化至工业规模合成，有望在温和水相条件下实现原子经济的可持续化学工业。全细胞生物催化利用工程微生物作为自包含、自复制的微型工厂，可避免昂贵的酶纯化并提供原位辅因子，因而备受关注。
然而，全细胞生物催化的规模化实施，尤其是涉及疏水底物或产物的多步级联反应，仍面临重大障碍。主要挑战是水相细胞环境与不互溶有机相之间跨相界的质量传递差，导致反应速率低下。此外，许多级联反应需要生物催化剂与化学催化剂协同（化学酶反应），两者往往在不相容条件下运行，而有机溶剂的直接接触也会损害细胞活力。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后，通过注射加入2-（甲基氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤，直至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。过滤产物，旋转蒸发除去溶剂后，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯:石油醚 = 1:3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化CD（ACD）的合成
首先，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，在冰浴中冷却至5 °C以下。随后，在剧烈搅拌下于5 min内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30 min，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1 h。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
其次，将4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，所得黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集形成的沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈:水:氨水 = 1:1:0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化CD（ACD）。
偶联物（cell@OBC）的制备
ⅰ）偶联物（cell@CD）的制备
将新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，在4 °C下反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，除去过量游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，最终偶联物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0，备用。
ⅱ）偶联物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液，在4 °C下反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，除去过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。然后，在乳液中加入100 mM底物引发反应。每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，然后用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的更多信息见Nature Portfolio Reporting Summary。
研究结果
活细胞两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从关键组分的模块化合成开始：胺化β-环糊精（ACD）主体和定制OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。在此基础上，研究团队对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行工程化改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，得到cell@CD偶联物（补充图6）。其次，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着经UV-Vis光谱确认，在330 nm处显示蒽醌部分的特征吸收，而在天然细胞与游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果为稳定的超分子连接提供了明确证据。关键的是，研究验证了蒽醌单元的光催化活性未因其偶联到OBC结构中而受阻，为后续研究提供了极佳起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD偶联物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）浓度，可精确控制细胞表面β-CD的密度，以相应荧光强度的增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD偶联物周围有清晰的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞无此信号，证实了β-CD主体的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ电位表征表面电荷，显示随着超分子负载增加，从天然细胞的−45 mV逐渐移至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可以被精确调控，以适应多样化的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估对胞内酶功能的影响，发现过度表面功能化虽然增加了疏水性，但显著降低了酶的保留活性（图2f）。这种下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，既赋予稳健的乳化性能，又保持超过97%的胞内酶活性。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外的传质屏障，研究裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了上述假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性和生物相容性
全细胞催化的一个关键优势是细胞为酶提供的保护环境。研究假设表面修饰可进一步保护细胞免受过程中常遇到的严苛条件影响。为验证这一点，研究将cell@OBC偶联物置于热和化学应激条件下。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，较未修饰天然细胞提高2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面——一种以诱导细胞裂解闻名的条件——cell@OBC偶联物在两小时后仍保持52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提升达2.8倍（图3b）。其他溶剂如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）也被测试，以进一步巩固聚合物对有机溶剂的保护能力（补充图12）。此外，经过2小时紫外线照射后，cell@OBC的保留活性仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色测定得到佐证，该测定可视化了cell@OBC偶联物在热和有机溶剂应激下相较于天然对应物的优越存活率（图3d-i）。
讨论与解读
本研究通过可调超分子表面化学策略，成功构建了基于Pickering乳液的活细胞生物催化平台。核心创新在于利用β-环糊精主体与油基光催化剂客体之间的主客体相互作用，将化学催化剂非共价锚定于活细胞表面，形成两亲性“超细菌”。该设计不仅赋予细胞界面自组装能力以稳定乳液，还通过表面超分子层显著增强了细胞对热、有机溶剂和紫外线等外部应激的耐受性。动态超分子连接方式实现了按需双模式回收——活细胞偶联物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着于新鲜细胞，兼顾了原子经济性和可持续性。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，该研究的核心价值在于将化学催化与生物催化整合于同一活细胞平台，通过超分子化学的“可逆”特性解决了传统化学酶催化体系中催化剂回收难的瓶颈。表面修饰的精确调控（18 mM EDC/14 mM NHS条件）在保持97%以上酶活性的同时实现乳化功能，体现了工程化思维。然而，该策略目前仍依赖手摇乳化等简单操作，放大至工业规模时的传质效率和乳液长期稳定性尚需进一步验证。将光催化与多酶级联整合的“装配线”概念，为绿色生物制造提供了值得关注的新方向。
参考来源
Wu X, Dimde M, Karring H, Wang Z, Wu C. Assembly-Line Biosynthesis in Living-Cell Emulsions via Tunable Supramolecular Surface Chemistry. Nat Commun. PMID: 42342679.
PMID: 42342679