来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母是合成生物学最常用的底盘细胞之一，但CRISPR编辑的效率瓶颈往往不在Cas9切割，而在向导RNA（sgRNA）的构建环节。传统方法依赖限制性内切酶和连接酶，操作繁琐且每次更换靶点都要重新克隆。2025年发表于《STAR Protocols》的一项工作给出了一套简化方案——用PCR扩增直接完成sgRNA的安装，配合Cas9质粒的无缝环化，让向导序列的迭代变得像换引物一样简单。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因组编辑在基础研究和工业菌株改造中应用极广。CRISPR-Cas9系统进入酵母领域后，编辑精度和效率大幅提升，但一个隐性瓶颈始终存在：sgRNA表达质粒的构建。传统做法是用限制性内切酶切开载体，再通过连接酶把双链DNA片段插进去，这一过程涉及酶切位点设计、酶活验证、连接效率优化等多个环节，每个新靶点都要重复一轮。
Rostamian等人提出的协议绕开了酶切-连接路线。核心思路是用PCR产物直接作为sgRNA的安装载体，同时让Cas9质粒在安装过程中实现无缝环化，无需额外引入酶切位点。这套方法不仅简化了构建步骤，更重要的是支持快速迭代——研究者可以在几天内完成多个向导序列的平行测试，而不必为每个向导单独设计克隆策略。协议还整合了供体DNA（HDR donor）的设计、大肠杆菌中的质粒验证以及酵母的LiAc/PEG共转化流程，形成从设计到克隆筛选的完整闭环。
研究方法
整个工作流程分为四个模块：sgRNA与HDR供体设计、向导插入Cas9质粒、大肠杆菌中的克隆与测序验证、以及酵母的共转化筛选。
培养基配制是实验的基础环节。LB液体培养基（含卡那霉素）的配方为：LB肉汤粉末25 g/L，卡那霉素储备液（50 mg/mL）终浓度50 μg/mL，加ddH₂O定容至1 L。121°C液体循环灭菌20–30分钟，冷却至约55°C后加入过滤除菌的卡那霉素，轻轻混匀。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存最多6个月，含卡那霉素的版本在4°C保存最多1个月。LB琼脂平板（含卡那霉素）则在上述基础上额外加入1.5%（w/v）的Bacto琼脂，灭菌后冷却至约55°C再加抗生素，倒板后室温凝固，4°C保存最多1个月。
酵母培养使用YPD液体培养基：葡萄糖2%（w/v）即10 g、蛋白胨2%（w/v）即10 g、酵母提取物1%（w/v）即5 g，ddH₂O定容至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温保存最多6个月。YPD琼脂平板（含G418）在基础配方中加入2%（w/v）Bacto琼脂，灭菌冷却后加入G418储备液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL。原文摘要未详述质粒骨架的具体序列信息，也未给出PCR扩增sgRNA引物的详细设计参数。
sgRNA与供体设计环节，协议要求同时设计单链向导RNA（sgRNA）和同源定向修复（HDR）供体。供体设计需包含与靶位点两侧同源的序列，并在编辑区域引入预期的突变或标记序列。原文摘要未提供具体的同源臂长度推荐值或GC含量要求。
向导插入与质粒环化是这套协议的核心创新。与传统酶切连接不同，该方法通过PCR扩增将sgRNA序列直接安装到带有KanMX/G418筛选标记的Cas9-sgRNA质粒上，同时实现质粒的无缝环化。这意味着不需要限制性内切酶识别位点，向导序列的两端只需与载体末端有足够的同源序列即可完成重组。原文摘要未详述PCR反应的聚合酶种类、退火温度或延伸时间等具体参数。
大肠杆菌中的克隆与验证流程为：将PCR产物转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒后进行测序验证。这一步确保进入酵母的质粒序列完全正确，避免因PCR引入突变而影响后续编辑效率。原文摘要未说明所用大肠杆菌菌株的具体名称。
酵母共转化采用经典的醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）方法。将测序验证过的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA同时转化入酿酒酵母感受态细胞。转化后经恢复培养，涂布于含G418的YPD平板上进行筛选——G418抗性由质粒上的KanMX标记提供。原文摘要未给出LiAc浓度、PEG分子量或热激温度与时间等参数。
研究结果
转化筛选的核心判据是菌落数量的“多对少”对比。在30°C培养2–3天后，同时转入Cas9-sgRNA质粒和HDR供体的实验组通常长出大量菌落，而只转质粒不转供体的对照组（–HDR donor）仅出现极少数菌落。这一差异源于Cas9切割的致死效应——如果靶位点被有效切割而缺乏修复模板，细胞将因DNA双链断裂无法修复而死亡。因此，“多对少”的菌落数对比不仅验证了转化和筛选体系正常工作，也同时确认了设计的向导RNA能在目标位点高效切割。
阳性克隆的分子验证通过菌落PCR完成。用跨越同源臂的引物筛选6–8个菌落时，正确编辑的克隆应扩增出预期大小的片段。缺失和插入突变会相对未编辑对照产生明显的条带位移，而点突变则可能需要测序进一步确认。对于成功的实验，至少有一部分被测菌落呈PCR阳性，跨接合位点的DNA测序应确认设计基因型的正确性，包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。
质粒清除是编辑流程的最后一步。在非选择性培养基（YPD）上培养后，一部分编辑克隆会自然丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过影印接种到YPD和YPD+G418平板上可以评估清除效果：已清除质粒的克隆在YPD上正常生长，但在含G418的平板上无法存活。这一步骤为后续无标记菌株的应用扫清了障碍。
讨论与展望
这套协议的价值在于把CRISPR编辑中最耗时的质粒构建环节压缩到了PCR尺度。传统酶切连接方法每更换一个靶点都需要重新设计酶切策略，而PCR引导插入只需合成新的引物即可完成sgRNA替换，这种差异在需要筛选多个候选靶点或构建多基因编辑菌株时尤为明显。选择KanMX/G418作为筛选标记也兼顾了操作便利性——G418抗性既可用于大肠杆菌筛选，又可直接用于酵母筛选，且后续可通过非选择性培养自然丢失，避免了繁琐的标记去除步骤。
值得注意的是，该协议对HDR供体的设计提出了明确要求——沉默PAM破坏突变的引入确保了编辑完成后Cas9不再被招募到已编辑位点，防止重复切割导致细胞死亡或基因组不稳定。这一细节体现了协议设计的完整性。原文摘要未提供编辑效率的定量数据，也未比较该方法与传统克隆方法的耗时差异，这些指标有待在实际应用中验证。对于需要高通量测试多个sgRNA活性的实验室而言，这套方法提供了一条值得尝试的简化路径。
参考来源：Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protocols. PMID: 42519825.
PMID: 42519825