来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
抗生素滥用引发的环境耐药性扩散已成为全球公共卫生危机。本研究从土耳其卡奇卡尔山水中分离出一株假单胞菌R11S16，从中克隆了一个YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化获得重组酯酶PsEstyfh。该酶分子量仅约23 kDa，具备低温活性（20 °C）、耐碱（pH 9）、耐盐（16% NaCl下保留约50%活性）等特性，更重要的是能在温和条件下使阿奇霉素的抗菌活性降低95%以上，且转化产物对浮萍无显著毒性。这是首例关于P. sivasensis来源YqiA/YcfP家族酯解酶的重组生产与功能表征报道。
研究背景
抗生素在人类治疗、动物饲养及食品保藏中的不当使用，已导致全球范围内抗菌药物耐药性（AMR）快速上升，成为公共卫生的重大威胁。耐药性不仅限制患者的治疗选择，还通过增加发病率、死亡率和住院时间给医疗系统带来沉重经济负担。据估计，仅美国每年就有超过35,000人死于耐药菌感染；若当前趋势持续，到2050年全球每年因抗生素耐药导致的死亡人数可能超过1000万，经济损失超过1000亿美元。释放到自然环境中的抗生素即使在低浓度下也会产生选择压力，加速耐药基因的发育与传播，环境抗生素污染与耐药性扩散之间存在直接关联。尽管许多国家已实施限制抗生素使用的国家行动计划，但人口增长、兽用和工业畜牧业中抗生素的持续使用，仍使抗生素残留不断进入环境，增加人群中耐药微生物的出现频率。在此背景下，寻找能够降解环境中抗生素残留的生物催化剂，成为缓解耐药性扩散的重要策略之一。
研究方法
材料与试剂
克隆所用酶、缓冲液及无核酸酶水购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA）。甘油、牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝R-250、β-巯基乙醇（βME）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸、正磷酸、溶剂及对硝基苯酚（p-NP）连接底物购自Sigma-Aldrich（Darmstadt, Germany）。培养基和缓冲液组分购自Merck（Darmstadt, Germany）。乙二胺四乙酸（EDTA）购自PanReac Applichem（Barcelona, Spain）。其他试剂和实验室设备（玻璃/塑料器皿）除非另有说明，均购自Tekkim（Bursa, Turkey）、Biobasic（Toronto, Canada）、AnalytiChem（Zedelgem, Belgium）和Condalab（Madrid, Spain）。
菌株的分子鉴定
一株耐冷菌株R11S16分离自卡奇卡尔山脉采集的水样（GPS坐标：40°52′54.01″ N, 41°08′23.26″ E）。以R2A琼脂为分离培养基，通过反复划线于营养琼脂上纯化分离株R11S16（Karakaya 2025）。使用PureLink® DNA分离试剂盒（Invitrogen, USA）按照制造商说明从过夜培养物中提取基因组DNA。使用通用细菌引物（27F和1525R）通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR产物经纯化后，使用ABI PRISM 3730 XL自动测序仪，以正向引物518F（Buchholz-Cleven et al. 1997）和反向引物800R（Chun and Goodfellow 1995）进行测序。
ABI格式的色谱文件使用Chromas 1.45版检查，引物重叠拼接获得分离株R11S16的16S rRNA基因核苷酸序列（FASTA格式）。所得16S rRNA基因序列已提交至GenBank，登录号为PP213417。将该序列上传至EzBioCloud服务器（Chalita et al. 2024），确定最近邻系统发育物种的成对序列相似性。使用MEGA X软件包（Kumar et al. 2018），以邻接法（neighbor-joining）、最大简约法（MP）和最大似然法（ML）构建系统发育树。树拓扑结构经Felsenstein（1985）方法进行1000次自举重采样评估。由于本研究主要聚焦于冷活性酯酶的功能表征，未进行基因组水平的分类学分析。
YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因的克隆
基于Pseudomonas sivasensis模式菌株基因组数据设计YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因的寡核苷酸引物，两端均含XhoI酶切位点（斜体）。使用NEB cutter v3.0（https://nc2.neb.com/NEBcutter2/?noredir）检测基因的限制性酶识别位点，使用SignalP-6.0网络工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）分析基因中可能的信号肽。使用Thermo Fisher Scientific Multiple Primer Analyzer（https://www.thermofisher.com）评估设计引物内部及相互之间形成二聚体的可能性。使用NEB Tm Calculator网络工具，结合PCR反应所用DNA聚合酶计算解链温度。
将P. sivasensis R11S16过夜新鲜培养物以10,000 × g离心10分钟收集细胞，使用Invitrogen™ PureLink™基因组DNA Mini Kit按照制造商指南提取基因组DNA。使用正向引物（5′-ATTCTCGAGCTGTATATCCACGGTTTC-3′）和反向引物（5′-AATCTCGAGCAGTGCCGAAAAATC-3′）扩增YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因。扩增反应在热循环仪微量管中进行，反应体系含：10X Taq缓冲液（3 µL）、Taq DNA聚合酶（0.25 µL，1.25 U）、基因组DNA（3 µL）、10 µmol正向引物（0.8 µL）、10 µmol反向引物（0.8 µL）、10 mM dNTP（0.8 µL）和无核酸酶水（18.95 µL）（Adıgüzel 2020）。反应混合物在热循环仪（Biorad-T100™, Hercules, CA）中先于95 °C预变性2分钟，然后进行30个循环：95 °C变性40秒、60 °C引物退火40秒、72 °C延伸60秒，最后72 °C终延伸5分钟。使用FavorPrep™质粒提取试剂盒（Favorgen, Pintung, Taiwan）从E. coli DH5α细胞中提取质粒pET20b(+)。PCR产物和pET20b(+)分别用XhoI（# ER0691）按制造商指南进行酶切。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后用GeneJET凝胶提取试剂盒回收，取6 µL PCR产物与2 µL线性化pET20b(+)连接，连接反应体系含1 µL 10X T4 DNA连接酶缓冲液、0.5 µL 5U/µL T4 DNA连接酶（# 15224041）和0.5 µL无核酸酶水，于25 °C孵育过夜（Tabor 1989）。取连接混合物（3.5 µL）通过热激转化法（Chung and Miller 1993所述方案）导入CaCl₂-感受态E. coli DH5α细胞（50 µL）。转化子在含终浓度50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长，随后对转化子重复提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，通过比较长度鉴定含重组分子的克隆（Choudhary and Laurie 1991）。验证后的重组分子采用相同转化方法亚克隆至E. coli BL21(DE3)中进行异源表达。
异源表达与纯化
将含重组分子的克隆接种至装有50 mL含氨苄青霉素LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，于37 °C、175 rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.4–0.6。随后向培养物中加入IPTG至终浓度0.3 mM，继续于18 °C、175 rpm振荡培养5小时（Adigüzel et al. 2023）。培养结束后，培养物以10,000 × g离心5分钟，收集上清液作为粗酶液。通过SDS-PAGE和酯酶活性测定验证表达情况。
粗酶液通过10-kDa分子量截留（MWCO）再生纤维素超滤膜（Ultracell®, Merck Millipore, MA, USA），使用Amicon™-搅拌超滤池（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）进行浓缩（Cilmeli et al. 2024）。将等体积的浓缩粗酶液与HisPur™ Ni-NTA树脂（Thermo Scientific™）轻轻混合，于4 °C保持1小时。未结合蛋白用磷酸盐缓冲液（50 mM, pH 7.4）洗脱，结合蛋白以洗涤缓冲液中100–400 mM咪唑线性梯度洗脱，流速0.3 mL/min（Adıgüzel et al. 2024）。收集具有酯酶活性的级分（每份1 mL），合并、浓缩，并对50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）透析以用于后续研究。
SDS-PAGE分析、总蛋白定量与酯酶活性测定
SDS-PAGE分析采用Laemmli（1970）方法的改良版，在10%丙烯酰胺凝胶上进行。电泳使用Mini-Protean Tetra Cell电泳系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）完成，考马斯亮蓝染色（Adigüzel and Tunçer 2016）后的蛋白条带使用Gel Doc XR系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）成像。酶液总蛋白浓度采用Bradford（1976）方法，以牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行定量。酯酶活性通过分光光度法在410 nm波长下监测对硝基苯酚（p-NP）的释放进行测定。
研究结果
菌株R11S16的系统发育归属
获得了菌株R11S16近乎完整的16S rRNA基因序列（1459 bp）。比较序列分析显示，菌株R11S16与Pseudomonas sivasensis P7T的序列相似性为100.0%，其次为Pseudomonas petroselini MAFF 311,094T（99.93%）和Pseudomonas extremaustralis 14-3T（99.86%）（表1）。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析将菌株R11S16置于假单胞菌属内，与P. sivasensis P7T紧密聚类（图1）。相似的树拓扑结构表明菌株R11S16具有稳定一致的系统发育位置。尽管若干密切相关的假单胞菌物种表现出较高的16S rRNA基因序列相似性，菌株R11S16在所有系统发育重建中均与P. sivasensis谱系的模式菌株稳定聚类，并获得强自举支持。菌株R11S16在胰蛋白胨大豆琼脂上形成光滑、圆形、奶油色菌落（图1），与假单胞菌属成员常见的表型特征一致（Méndez et al., 2017）。值得注意的是，分析中纳入的若干系统发育相关物种此前已有从寒冷或温带环境分离的报道，支持菌株R11S16作为耐冷细菌和冷活性酶潜在来源的生态相关性（Duman et al. 2020; Xiong et al. 2023）。基于16S rRNA基因序列相似性和与模式菌株的系统发育聚类，菌株R11S16被鉴定为P. sivasensis。该分子鉴定水平被认为足以为此后聚焦于该菌株所产冷活性酯酶的生化表征和工业应用潜力提供可靠的分类学框架。
克隆、异源表达与纯化
从P. sivasensis R11S16分离株基因组DNA中PCR扩增的YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因（yfh）经电泳分析，在0.8%琼脂糖上观察到约600 bp的单一条带，与预期相符（补充信息1）。扩增的yfh基因与pET20b(+)成功经XhoI双酶切、连接，所得构建体（pET20b(+)-yfh）转化至E. coli DH5α（补充信息2）。在含氨苄青霉素的培养基上于37 °C过夜生长的转化子，通过比较快速提取质粒的大小筛选含有pET20b(+)-yfh的克隆（补充信息3）。重组分子中的插入片段通过通用T7启动子（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和T7终止子（5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）引物测序鉴定。由此验证了重组分子及基因方向。此外，使用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa）将克隆基因与P. sivasensis模式菌株中的同源基因进行比对，并在Jalview中可视化（Waterhouse et al. 2009）（补充信息4）。据此，分离株R11S16的yfh基因中第108、254、256、257、275和297位核苷酸与P. sivasensis模式菌株不同。基于NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）数据库的蛋白分析结果显示，该基因产物的氨基酸序列与来自P. sivasensis（蛋白登录号：WP_181640331.1）、Pseudomonas cyclaminis（蛋白登录号：WP_122305492.1）、Pseudomonas fluorescens（蛋白登录号：WP_191946927.1）、Pseudomonas grimontii（蛋白登录号：WP_090400878.1）、Pseudomonas rhodesiae（蛋白登录号：WP_348749120.1）和Pseudomonas azotoformans（蛋白登录号：WP_071497189.1）的YqiA/YcfP家族α/β水解酶分别有97.0%、96.5%、95.5%、95.5%、95.0%、94.5%和94.0%的一致性。最后，验证后的重组分子被亚克隆至E. coli BL21(DE3)。
yfh基因在T7启动子控制下以组氨酸标签（6X-His）形式胞外表达。基因表达通过SDS-PAGE分析评估（图2a）。在丙烯酰胺凝胶上，与含和不含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液相比，含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液中观察到约23 kDa的独特蛋白条带，证明yfh基因的表达。此外，从含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)经IPTG诱导的培养物中回收的粗酶液酯酶效价为56.83 ± 0.82 U/mL。相比之下，在相同条件下生长的含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)培养物中未检测到胞外酯酶活性。表达的重组蛋白被命名为PsEstyfh。PsEstyfh的比活性为170.10 ± 5.09 U/mg蛋白。SDS-PAGE分析还显示，该酶的分子量低于来自Pseudomonas sp. TB11（Dong et al., 2015）、Serratia sp.（Jiang et al., 2016）、Zunongwangia profunda（Rahman et al., 2016）、Bacillus halodurans（Noby et al., 2020）、Pseudomonas sp. E2-15（Liu et al., 2021）、Deinococcus radiodurans（Zhang et al., 2021）、Pseudomonas sp. E5-12（Liu et al., 2022）、Aphanizomenon flos-aquae（Knepp et al., 2022）、Arthrobacter soli（Cao et al., 2023）、Halobacterium salinarum（Ortega-de la Rosa et al., 2024）、Haloarcula japonica（Kato et al., 2025）和Aspergillus niger（Xing et al., 2025）的冷活性酯酶。另一方面，其分子量与来自Psychrobacter pacificensis（Wu et al., 2013）、Bacillus cohnii（Noby et al., 2018）和Lysinibacillus sp.（Matrawy et al., 2022）的冷活性酯酶相似。总之，PsEstyfh可能是迄今报道的最小的冷活性酯解酶。PsEstyfh的小尺寸特性使其值得用于与其他冷活性酶（特别是漆酶）构建融合蛋白，以应用于生物修复。
PsEstyfh的生物信息学分析
Protparam分析确认所表达酶的分子量约为23024.75 Da。分析显示该酶的等电点为6.11，在大肠杆菌中的半衰期超过10小时。PsEstyfh的不稳定指数计算为37.26，表明该酶在体外具有较好的稳定性。
PsEstyfh的三维结构建模
温度对PsEstyfh酯解活性的影响
pH对PsEstyfh活性的影响
NaCl对PsEstyfh酯解活性的影响
金属离子和化学试剂对PsEstyfh催化活性的影响
有机溶剂对PsEstyfh活性的影响
PsEstyfh的底物特异性与动力学参数
PsEstyfh与底物的分子对接分析
PsEstyfh介导的阿奇霉素抗菌活性降低
生态毒理学评估
讨论与解读
本研究报道了一种来自P. sivasensis R11S16的此前未被表征的酯解酶，并成功在大肠杆菌中表达。该酶展现出多种理想生化特性的罕见组合：低温下强活性、嗜碱偏好、宽pH范围内显著稳定性、对多种添加剂（NaCl、溶剂、金属离子和化学试剂）的中等耐受性，以及紧凑的分子结构。这些特性使其尤其适用于废水处理应用。此外，该酶几乎完全消除阿奇霉素抗菌活性的能力，以及过程中释放的转化产物未引起毒性效应，凸显了PsEstyfh作为大环内酯类抗生素生物催化去除和减少环境耐药性扩散的有力工具。除环境应用外，该酶还适用于洗涤剂、纺织和制药工业。此外，酶的小分子尺寸为合成生物学应用提供了显著优势，特别是在设计多功能融合酶以扩展催化多样性、去除结构多样的外源化合物方面。
编译者解读
PsEstyfh的独特价值在于"小"与"冷"的结合——23 kDa的分子量使其成为已知最小的冷活性酯酶之一，这为构建多功能融合酶提供了理想的骨架蛋白。阿奇霉素去除实验达到95%以上的抗菌活性降低，且转化产物对浮萍无毒，说明该酶在实际环境修复中具备可行性。不过，研究仍停留在实验室规模的表征阶段，粗酶液56.83 U/mL的效价距离工业化应用还有距离。未来值得探索的方向包括：将该酶与漆酶等构建融合蛋白以拓宽底物谱、通过定向进化提升其在废水复杂基质中的稳定性，以及评估真实环境样本中的去除效率。合成生物学时代，这类来自极端环境的"小众"酶正成为构建人工降解途径的宝贵元件库。
PMID: 42245393