来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）正从一种鲜为人知的细菌胞外多糖，转变为合成生物学领域备受关注的功能性生物聚合物。其独特的流变学特性和结构特征，使其在食品、医药和材料科学中展现出应用潜力。然而，MLG生物合成机制的完整性长期悬而未决——已知第二信使c-di-GMP和双顺反子操纵子bgsBA参与调控，但转运与组装环节的关键蛋白始终缺失。
近日，西班牙研究团队在《Microbial Biotechnology》发表论文，揭示外膜蛋白TolC是苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）合成MLG的必需组分。通过基因敲除、回补表达及多基因共过表达策略，研究人员不仅阐明了TolC在MLG生物合成中的功能角色，还构建了高效生产模块——在生物反应器条件下MLG产量达到约10 g/L，较对照提升8倍。更值得关注的是，该遗传模块可移植至非产MLG的根瘤菌宿主中，实现异源从头合成。
研究背景
MLG是一类由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的线性多糖，广泛存在于禾本科植物细胞壁，但在原核生物中仅少数根瘤菌可合成。这类聚合物的独特之处在于其"混合连接"结构赋予的水合能力和凝胶特性，使其可作为食品增稠剂、生物材料前体甚至膳食纤维补充剂。
在根瘤菌中，MLG的生物合成受第二信使c-di-GMP严格调控。当胞内c-di-GMP水平升高时，双顺反子操纵子bgsBA被激活，编码糖基转移酶BgsA和可能的聚合/转运蛋白BgsB。然而，完整的合成机器组成——特别是聚合物如何跨越外膜完成分泌——一直未被阐明。此前研究提示，革兰氏阴性菌中许多多糖和蛋白的分泌依赖外膜蛋白通道，但MLG系统中是否存在类似组分，学界并无定论。
TolC是革兰氏阴性菌中典型的"三组分外排系统"外膜通道蛋白，参与多种底物（包括药物、毒素和部分多糖）的跨膜转运。能否将TolC与MLG合成联系起来，成为解决MLG分泌机制谜题的关键突破口。
研究方法
菌株与培养条件
研究涉及多种根瘤菌和E. coli菌株。S. meliloti、Mesorhizobium japonicum和Rhizobium etli常规培养于添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY）或最小培养基（MM）中。MM培养基成分明确：每升含10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃和0.05 g NaCl，另添加1 mL 1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素和0.1 g/L泛酸钠）。
温度控制区分菌种：S. meliloti和M. japonicum于28°C培养，R. etli于30°C培养，用于克隆和接合的E. coli于37°C在LB培养基中培养。抗生素及添加物终浓度如下：四环素（Tc）10 μg/mL（R. etli为5 μg/mL）、卡那霉素（Km）50 μg/mL、刚果红（CR）50 μg/mL、荧光增白剂（CF）200 μg/mL、IPTG 1 mM。所有质粒通过E. coli β2163或S17.1供体菌株接合转移进入根瘤菌。
三突变体构建
为排除其他c-di-GMP调控胞外多糖对MLG产量的干扰，研究人员在S. meliloti 8530中构建了三重突变体。具体策略是依次对wgcA（EPS II合成）、exoY（EPS I合成）和uxs1-uxe（APS合成）三个基因进行框内删除。每步突变均通过PCR进行遗传水平确认，并通过相应EPS表型消失进行微生物学验证。最终获得的三突变体命名为IBR606。
摇瓶MLG生产与定量
MLG定量采用地衣多糖酶（lichenase）消化后测定葡萄糖当量的方法。根瘤菌在含100 mL Erlenmeyer摇瓶的20 mL液体MM培养基（添加适宜浓度Tc）中培养3天，S. meliloti菌株于28°C、170 rpm振荡，R. etli菌株于30°C、170 rpm振荡。初始OD₆₀₀调整为0.05。
TolC功能验证与过表达模块
通过接合转移将携带tolC的质粒导入相关菌株，检测MLG合成恢复情况。为构建高产模块，研究人员共过表达tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶基因pleD**，并与不含tolC*的对照质粒进行比较。生物反应器条件下评估最终产量。
异源表达实验
将包含tolC-bgsBA-pleD**的完整遗传模块导入M. japonicum*等天然不产MLG的根瘤菌宿主中，检测其是否获得MLG从头合成能力。
研究结果
三重突变体未显著改变MLG产量
在生理c-di-GMP水平下，野生型S. meliloti 8530的MLG产量低于检测限。三重突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）的MLG产量较野生型无显著提升。当引入携带组成型活性二鸟苷酸环化酶的质粒pJBpleD*以提高胞内c-di-GMP水平后，IBR606的MLG产量被显著促进，虽略高于野生型但无统计学差异。这一结果表明，EPS I、EPS II和APS的合成能力缺失对MLG产量无实质性影响。
TolC缺失彻底阻断MLG合成
遗传敲除tolC基因后，S. meliloti完全丧失MLG合成能力。回补实验证实，重新引入功能性tolC可恢复MLG产生。这一结果明确将TolC置于MLG生物合成必需组分的核心位置。
三基因共过表达实现8倍增产
在摇瓶条件下，同时过表达tolC、bgsBA和pleD**的菌株，其MLG产量较不含tolC*的对照质粒菌株提升8倍。这一数据强有力地表明，TolC是MLG合成通路中的限速因子之一，仅靠bgsBA和c-di-GMP信号不足以支撑高效聚合物合成。
生物反应器产量达约10 g/L
将优化后的遗传模块应用于生物反应器规模化生产，MLG最终产量达到约10 g/L。这一数值在微生物多糖生产中处于较高水平，证明该模块具备工业应用潜力。
模块可移植性验证
将tolC-bgsBA-pleD**完整模块导入天然不产MLG的M. japonicum*等根瘤菌宿主后，成功实现了MLG的从头合成。这一结果不仅验证了模块的可移植性，更为"底盘菌株交换"策略提供了实证——即通过更换宿主菌株来优化生产性能。
讨论与展望
TolC的发现补齐了MLG生物合成机器的最后一块拼图。研究人员提出，TolC与BgsA、BgsB共同构成三组分复合体，协同完成聚合物的合成与跨外膜转运。这一模型与革兰氏阴性菌中广泛存在的"三组分外排系统"架构高度吻合，提示MLG分泌可能采用类似的"通道-适配器-内膜转运体"机制。
从应用层面看，8倍增产和约10 g/L的生物反应器产量，使MLG的微生物工业化生产具备了现实可行性。而模块在不同根瘤菌宿主间的成功移植，展示了合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环的典型范例——一个功能明确的遗传模块，可以跨越物种边界，在异源宿主中重建完整代谢通路。
值得注意的是，本研究在S. meliloti中通过删除其他c-di-GMP调控EPS的合成基因来简化胞外多糖背景，但这一策略并未显著提升MLG产量。这提示MLG合成的瓶颈可能不在于碳流竞争，而更多取决于TolC等分泌组分的表达水平。未来研究可聚焦于TolC-BgsA-BgsB复合体的结构解析，以及通过蛋白质工程优化其相互作用效率，进一步突破产量上限。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology. PMID: 42552791.
PMID: 42552791