来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
碱性蛋白酶在工业应用中价值巨大，但异源表达常受细胞毒性与分泌瓶颈制约。本研究将定向进化、机器学习辅助突变与信号肽工程三者串联，在毕赤酵母中实现了PrtA分泌量4.98倍的提升。15-L发酵罐中，优化菌株产酶达4807.5 U/mL，折合蛋白浓度1.5 g/L。
研究背景
微生物丝氨酸蛋白酶因底物谱广、稳定性好，在洗涤、食品、制革等领域应用广泛。PrtA是一种耐酸的碱性丝氨酸蛋白酶，具备良好的工业应用潜力。然而，在微生物宿主中异源过表达这类蛋白酶，往往面临两个棘手问题：一是蛋白酶对宿主细胞具有毒性，过量积累会损伤细胞；二是分泌效率低下，大量产物滞留在胞内。
毕赤酵母（Komagataella phaffii，又名 Pichia pastoris）是常用的真核表达宿主，具备蛋白折叠与翻译后修饰能力，适合分泌表达复杂蛋白。但即便使用毕赤酵母，PrtA的胞外产量仍不理想。传统策略多聚焦于单一环节——要么改造启动子，要么优化培养条件，要么更换信号肽。本研究则试图打出一套"组合拳"：先用定向进化提升蛋白自身的可分泌性，再用机器学习预测关键突变位点，最后筛选匹配的信号肽。三步叠加，效果如何？
研究方法
菌株、载体与培养基
研究选用 E. coli Trans1-T1 作为克隆宿主，K. phaffii GS115 作为表达宿主。表达载体为 pPIC9 和 pPICZαA。蛋白酶底物采用牛乳酪蛋白钠盐（Sigma-Aldrich，货号C8654）。限制性内切酶 EcoRI、NotI、DraI 购自 Thermo Fisher Scientific。其他化学试剂均为分析纯。
培养基包括 BMGY（缓冲甘油复合培养基）、BMMY（缓冲甲醇复合培养基）、MD（最低葡萄糖培养基）和 MM（最低甲醇培养基），配制方法参照 EasySelect™ Pichia Expression Kit（Invitrogen）说明书。
质粒构建
编码丝氨酸蛋白酶 PrtA 的基因（GenBank编号XP_663162）按毕赤酵母密码子偏好性优化后，由华大基因合成。成熟 PrtA 编码片段用特异性引物 PrtA-MF 和 Prt-MR（表S1）扩增，通过同源重组无缝克隆至 pPIC9 质粒，与 α-factor 信号肽序列形成框内融合，构建 pPIC9-prtA-M。重组质粒经测序验证插入正确。
转化与表达
重组质粒用 Bgl II 限制性内切酶线性化，电转化进入毕赤酵母 GS115 感受态细胞。蛋白表达诱导参照 EasySelect™ Pichia Expression Kit 说明书。His⁺ 转化子先在 MD 琼脂板和 MM 琼脂板上30°C培养48 h进行初步筛选。用无菌牙签挑取单菌落进行后续验证。
定向进化与机器学习辅助突变
研究者对 PrtA 进行定向进化，获得 Q245K 突变体。随后利用自主开发的机器学习模型 MPEPE（Mutation Predictor for Enhanced Protein Expression）预测与蛋白分泌相关的关键残基。模型打分最高的位点进行饱和突变，筛选出 I342D 突变体。将两个有益突变叠加，构建双突变体 PrtA-Q245K/I342D。
信号肽筛选
评估了九种信号肽对双突变体分泌效率的影响。九种信号肽包括血清白蛋白信号肽、不含前肽区的 α-factor 信号肽、PrtA 自身天然信号肽等。对照实验包括含前肽区的 α-factor 信号肽。
发酵放大
优化后的菌株在15-L补料分批生物反应器中进行放大培养。发酵上清液中的蛋白酶活性以 U/mL 为单位测定，蛋白浓度以 g/L 表示。原文摘要未详述发酵温度、pH控制策略、诱导时间及补料方案等具体参数。
研究结果
单点突变的效果
定向进化获得的 Q245K 突变体，胞外表达量比野生型 PrtA 提高1.35倍。机器学习模型 MPEPE 预测的关键位点经饱和突变后，筛选出的 I342D 突变体产量提升1.48倍。两个突变各自都有贡献，但幅度有限——单点突变至多提升不到50%。
双突变体的协同效应
将 Q245K 与 I342D 叠加后，双突变体 PrtA-Q245K/I342D 的分泌量达到野生型的1.84倍。1.35 × 1.48 ≈ 2.0，实际值1.84略低于乘积，但明显高于任一单突变体。更重要的是，双突变没有改变酶学性质——催化活性、底物特异性、pH稳定性均与野生型一致。这表明两个突变位点分别作用于蛋白折叠或分泌通路的不同环节，互不干扰。
信号肽筛选的意外发现
九种信号肽的筛选结果颇有意思。血清白蛋白信号肽、不含前肽区的 α-factor 信号肽、以及 PrtA 自身天然信号肽，三者均使双突变体的分泌量再翻一倍，最终达到野生型的4.98倍。
反观含前肽区的 α-factor 信号肽，产量急剧下降。α-factor 前肽区在酿酒酵母中本用于指导蛋白通过分泌通路，但在毕赤酵母中却成了累赘——可能干扰了 PrtA 的成熟加工，或导致蛋白滞留在内质网。
发酵罐放大验证
15-L补料分批发酵中，优化菌株产 PrtA-Q245K/I342D 达4807.5 U/mL，折合蛋白浓度1.5 g/L。这是摇瓶水平的数倍提升，验证了该策略的工业化潜力。原文摘要未提供野生型菌株在发酵罐中的对照数据，因此无法计算放大过程中的具体增益倍数。
讨论与展望
这项研究的亮点在于策略的叠加逻辑。定向进化解决"蛋白自身好不好分泌"的问题，机器学习解决"该改哪里"的效率问题，信号肽筛选解决"分泌通道匹不匹配"的问题。三步各自独立，效果又能相乘——4.98倍的总提升，接近1.35 × 1.48 × 2的乘积，说明三个环节的增益互不干扰。
机器学习模型 MPEPE 的引入值得关注。传统定向进化依赖随机突变加高通量筛选，耗时费力。MPEPE 从序列特征预测影响分泌的关键残基，把搜索空间从"全蛋白随机"缩小到"少数候选位点"，饱和突变的工作量大幅降低。I342D 的发现速度与效果，验证了这种"预测-验证"路线的可行性。
信号肽筛选的结果提示，毕赤酵母中信号肽的选择不能照搬酿酒酵母经验。α-factor 前肽区在毕赤酵母中的负面效应，可能解释了为何许多蛋白酶在毕赤酵母中表达不佳——问题未必出在蛋白本身，而在于信号肽不匹配。
当然，本研究仍有未解之处。原文摘要未详述 Q245K 和 I342D 两个突变如何从分子层面促进分泌——是增强了与分子伴侣的互作，还是减少了内质网滞留？此外，15-L发酵罐的工艺参数（温度、pH、甲醇诱导策略）未公开，这些信息对工业放大至关重要。未来若能在机制层面阐明突变的作用模式，这套策略或可推广至其他难表达蛋白的生产。
参考来源
Zhao B, Zhou Q, Wei P, Zhang H, Qin X. A combined strategy for high-efficiency expression of alkaline protease PrtA in Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris). Microb Cell Fact. PMID: 41808135.
PMID: 41808135