甲醇驱动：工程化毕赤酵母实现黑素焦糖色素高效生物合成

📅 2026-08-11 📰 Nat Commun 2026 Mar 17 📂 研究进展 👁 17

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

甲醇这种廉价的一碳原料，正在成为微生物细胞工厂的“新宠”。一项最新研究利用工程化Komagataella phaffii（毕赤酵母）以甲醇为碳源，将尿黑酸产量提升66倍，并进一步合成了具有广泛应用前景的焦黑素（pyomelanin）。该工作发表于Nature Communications，为焦黑素的工业化生产提供了一条可行路径。

▲ The pyomelanin biosynthetic pathway is divided into two processes. The first process is the synthesis of homogentisic acid (HGA) from methanol via three endogenous modules, including the central carbon metabolic pathway (Module I), shikimate pathway (Module Ⅱ), and HGA synthesis pathway (Module Ⅲ).

研究背景

焦黑素是一种天然的黑色素类色素，在防晒、生物材料、光电设备等领域具有广阔应用前景。然而，从天然生产者中直接提取焦黑素的产量极低，难以满足工业需求。利用微生物细胞工厂进行生物合成，被视为一种可持续且经济可行的替代方案。但焦黑素的生物合成途径涉及多个酶促反应模块，如何平衡各模块的表达、提高关键酶的催化效率，是亟待解决的核心问题。

K. phaffii（又称毕赤酵母）作为一种成熟的工业宿主，具有甲醇诱导表达系统、蛋白分泌能力强等优势，已被广泛用于重组蛋白生产。然而，利用该菌株进行焦黑素合成的研究此前鲜有报道。这项研究正是从K. phaffii出发，通过多模块平衡、定向进化、半理性设计等策略，系统提升了焦黑素的合成效率。

研究方法

菌株与质粒构建

研究以K. phaffii GS115（Invitrogen）为宿主菌，Escherichia coli TOP10F'（Invitrogen）用于质粒构建与扩增，E. coli BL21(DE3)（Sangon Biotech）用于蛋白表达。考虑到遗传稳定性，研究选用pZACH质粒进行基因过表达整合，并通过Cre/loxP ZeoR标记循环回收法确保每次整合的稳定性。基因敲除则使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达与纯化使用pET-28a质粒。来自Alcaligenes faecalis的羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）基因和来自Yarrowia lipolytica的酪氨酸转氨酶（TYRB）基因经密码子优化后由Generay（上海）合成。

培养基与培养条件

所有E. coli菌株在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37°C培养。重组酵母菌株分别在YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）或BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）中培养。

HGA生物合成途径的构建

K. phaffii自身具有HGA合成途径。研究首先测试了野生型（WT）菌株的HGA生产能力。经过5天摇瓶发酵，HGA产量达到25 ± 0.85 mg/L，但上清液未见明显颜色变化，OD400仅为0.006。随后，研究在培养基中补充不同浓度的L-酪氨酸，但HGA产量并未显著提升。这说明K. phaffii自身的HPPD和TYRB酶催化效率较低。

研究进而探索了不同来源的HPPD和TYRB基因，最终确定A. faecalis来源的HPPD和Y. lipolytica来源的TYRB为候选基因。通过多拷贝整合策略优化AfHPPD表达——将三个AfHPPD拷贝整合到基因组的不同位点（HIS4、INT1和INT18），获得菌株Pyo9，其HGA产量达到64.1 ± 0.68 mg/L。与WT菌株相比，Pyo9菌株的上清液呈现更深的浅棕色，OD400为0.362，这可能是HGA自氧化聚合所致。

焦黑素颜色筛选系统与定向进化

研究建立了基于颜色的焦黑素筛选系统，并利用该系统对3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHPS）进行定向进化，同时对羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）进行半理性设计改造。原文摘要未详述定向进化和半理性设计的具体操作参数。

5-L发酵罐高密度发酵

在5-L发酵罐中进行高密度发酵，发酵时间为204小时。

焦黑素表征与聚合方式比较

研究比较了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理两种方式合成焦黑素的差异。原文摘要未详述具体表征手段和参数。

研究结果

模块平衡实现HGA产量66倍提升

通过平衡三个不同的生物合成模块，研究将尿黑酸（HGA）的产量提升了66倍。具体而言，WT菌株经5天摇瓶发酵HGA产量为25 ± 0.85 mg/L，而经过多模块平衡优化后的工程菌株，HGA产量显著提升。研究还发现，与TYRB相比，HPPD的过表达对HGA产量的影响更大，这与文献报道的HPPD是HGA生物合成途径关键酶一致。

菌株Pyo29实现最高产量

经过5-L发酵罐204小时高密度发酵，工程菌株Pyo29实现了70.5 ± 0.7 g/L的焦黑素最高产量。这一产量水平在已报道的微生物合成焦黑素研究中处于领先地位。

焦黑素聚合方式差异

研究揭示了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理所得焦黑素之间的差异。原文摘要未提供两种聚合方式所得焦黑素的具体性质对比数据。

焦黑素应用潜力验证

研究最后展示了焦黑素的潜在应用价值。原文摘要未详述具体应用场景和验证数据。

▲ a TYRB和HPPD基因的异源筛选。b YlTYRB与AfHPPD的拷贝数优化策略。c 添加不同金属离子对HGA产量和OD400的影响。d 野生型（WT）、Pyo9菌株及添加Cu²⁺的Pyo9菌株的OD400和颜色比较。e AfHPPD蛋白的SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白标记；泳道1，全细胞蛋白上清液；泳道2，纯化的AfHPPD蛋白。该数据以三个生物学重复表示。f 金属离子对AfHPPD酶活性的影响。数据为3个生物学重复的平均值，带误差棒。

讨论与展望

这项研究的核心贡献在于，通过系统性的模块平衡策略，将K. phaffii的HGA产量提升了66倍，并最终在5-L发酵罐中实现了70.5 ± 0.7 g/L的焦黑素产量。这一产量数据在微生物合成焦黑素领域具有竞争力。研究建立的焦黑素颜色筛选系统，为后续菌株改造提供了便捷的高通量筛选工具——颜色变化直接反映HGA产量，无需复杂的色谱检测，这大大加速了定向进化和半理性设计的筛选周期。

另一个值得关注的亮点是碱性氧化聚合与漆酶处理两种聚合方式的对比。聚合条件直接影响焦黑素的结构和性质，进而影响其应用场景。该研究明确指出这两种方式所得焦黑素存在差异，这提示研究者需根据目标应用选择合适的聚合策略。

当然，从实验室规模到真正的工业化生产，仍有关键参数需要优化——原文未披露发酵过程中的碳氮比、pH控制策略、甲醇流加方案等细节。此外，焦黑素的提取纯化工艺、批次间一致性等问题也需进一步验证。但无论如何，这项研究为甲醇基焦黑素合成提供了坚实的理论依据和可行的技术路线。

▲ a 基于脓黑素颜色系统的变异体筛选通用流程。b PCSS的可行性分析。c 含BMMY培养基的24孔板中，不同变异体经甲醇诱导后的菌株颜色差异。d 过表达不同变异体对HGA产量及OD 400的影响。e

参考来源

Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nat Commun. PMID: 41839868.

PMID: 41839868

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