来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，受此启发，研究者开发了一种在Pickering乳液中运行的"工厂式"活细胞生物催化平台。该平台利用可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的大肠杆菌表面，形成两亲性"超细菌"，可自组装于水-油界面并稳定乳液。该策略使化学酶催化和多酶级联反应速率较传统双相体系最高提升45倍，并支持单步、序贯和一步级联反应，包括克级苯偶姻合成。更重要的是，动态超分子连接实现了按需双模式回收——活细胞偶联物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞上。
研究背景
自然界中的酶级联反应堪称化学制造的巅峰，能将简单前体转化为复杂高价值分子，其精妙之处在于将多种酶组织在特定细胞微环境中，从而克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等难题。全细胞生物催化利用工程微生物作为自包含、自复制的微型工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并原位提供必要辅因子，因而备受关注。然而，涉及疏水底物或产物的多步级联反应在实际应用中面临显著障碍：水相细胞环境与不混溶有机相之间的传质效率低下，导致反应速率缓慢；许多级联需要生物催化剂与化学催化剂协同作用（化学酶反应），而两者往往在不相容的条件下运行；有机溶剂的直接接触还可能损害细胞活性。这些瓶颈促使研究者探索新的界面生物催化策略。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后，通过注射加入2-（甲基氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤，直至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。产物过滤，粗产物（有机相）经旋转蒸发除去溶剂后，通过柱色谱纯化（乙酸乙酯:石油醚 = 1:3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化CD（ACD）的合成
首先，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，在冰浴中冷却至5 °C以下。随后，在对溶液剧烈搅拌的同时，于5分钟内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30分钟，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1小时。所得沉淀过滤收集，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
其次，将4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，所得黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。所得沉淀过滤收集，依次用乙醇和乙醚洗涤，并通过柱色谱进一步纯化（乙腈:水:氨水 = 1:1:0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化CD（ACD）。
偶联物（cell@OBC）的制备
ⅰ）偶联物（cell@CD）的制备
将新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，在4 °C下反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，去除过量游离ACD和未反应试剂。产物离心收集，最终偶联物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0，备用。
ⅱ）偶联物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液，在4 °C下反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，去除过量游离OBC。产物（cell@OBC）离心收集。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。随后，在乳液中加入100 mM底物启动反应。在每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，再用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的进一步信息见《自然》作品集报告摘要。
研究结果
活细胞两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从关键组件的模块化合成开始：胺化β-环糊精（ACD）主体和定制OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度通过¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。在此基础上，研究者对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行工程化改造。"超细菌"颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，得到cell@CD偶联物（补充图6）。其次，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合作用自发组装到细胞表面，形成最终cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着通过UV-Vis光谱确认，该光谱显示cell@OBC在330 nm处出现蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞和游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果为稳定的超分子连接提供了明确证据。关键的是，研究者验证了蒽醌单元的光催化活性未因其偶联到OBC结构中而受阻，为后续研究提供了极佳的起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究者使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD偶联物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的一个核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）的浓度，可以精确控制细胞表面β-CD的密度，通过相应的荧光强度增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD偶联物周围有清晰的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞无此荧光，确认了β-CD主体成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ-电位表征表面电荷，显示从天然细胞的−45 mV随超分子负载量增加逐渐移至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可以被精确调控，以适应多样化的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究者使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估了对胞内酶功能的影响，发现过度表面功能化虽然增加了疏水性，但显著降低了酶的保留活性（图2f）。这种下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究者确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，在保持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健的乳化性能。为进一步确认超分子层附着到细胞表面不会引入额外的传质障碍，研究者裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了研究者的假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的一个关键优势是细胞为酶提供的保护环境。研究者假设表面修饰能进一步保护细胞免受过程中常见的严苛条件影响。为验证这一点，研究者将cell@OBC偶联物置于热和化学应激条件下。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，较未修饰的天然细胞提高了2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面——一种公认诱导细胞裂解的条件——cell@OBC偶联物在两小时后仍保持52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提高了2.8倍（图3b）。其他溶剂如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）也被测试，进一步巩固了聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经过2小时紫外线照射后，cell@OBC的保留活性仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色实验得到证实，该实验直观显示了cell@OBC偶联物在热和有机溶剂应激下相比天然对应物具有更优的存活率（图3d-i）。
（中间部分结果内容因原文节选截断，以下为已提供部分的忠实翻译）
Pickering乳液的构建与界面催化性能
研究者进一步考察了偶联剂浓度对乳液液滴形态和cell@OBC疏水性的影响（图4a）。在甲苯-水双相条件下，天然细胞（左侧）与cell@OBC（右侧）的行为差异显著（图4b）。cell@OBC在广泛的溶剂中表现出优异的耐受性，能与多种有机溶剂形成稳定乳液（图4c，插图比例尺：1 cm）。乳液在0小时（图4d）和24小时（图4e）的外观对比清晰可见。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示了油包水乳液的结构，绿色代表水相（图4f）。光学显微镜图像进一步确认了乳液的形成（图4g）。不同储存时间下乳液的CI值显示，经过48小时储存后，乳液趋于最终状态（图4h，插图比例尺：0.5 cm）。乳液储存24小时后的三维CLSM图像（图4i）和放大细节（图4j）揭示了液滴的精细结构。含GFP蛋白的cell@OBC稳定的乳液的二维CLSM图像（图4k）和三维CLSM图像（图4l）进一步证明cell@OBC存在于水-油界面以稳定乳液。界面处GFP蛋白的荧光强度作为乳液粒径的额外证据（图4m）。cell@OBC稳定的乳液液滴的数量和尺寸分布（水油比 = 6:4）如图4n所示。不同水相比例（10%至80%）下cell@OBC稳定的乳液液滴的界面面积如图4o所示。
界面生物催化性能
研究者直观展示了cell@OBC稳定的界面生物催化过程（图5a）。不同水油比乳液中BAL酶活性如图5b所示。OBC作为光催化剂将苯甲醇转化为苯甲醛（绿色），双相体系作为阴性对照（灰色）（图5c）。Cal B催化的水解反应（图5d）和酯化反应（图5e）证明了乳液中酶反应的多样性。通过在活细胞内过表达ATA（图5f）、RR ADH（图5g）和BAL（图5h），将三种不同的酶反应扩展到乳液中。图5b–h的结果为三次平行实验的平均值，误差棒代表三次平行测量的标准差，n = 3。
级联催化组装线
研究者设计了定制级联催化组装线方案，实现从简单底物到高附加值化学品的转化（图6a）。ATA和RR ADH作为级联反应的首次探索（图6b）。通过ADH ht和BAL两种酶的组合验证了可扩展的多酶级联催化方案（图6c）。Cal B与cell@OBC表面的光响应单元结合，开启了光酶级联催化的可能性（图6d）。基于ATA、LK ADH和Cal B的三步序贯级联催化示意图如图6e所示。序贯级联中第一步和第二步的催化效率如图6f所示，反应后乳液体系保持稳定（插图比例尺：20 μm）。该实验独立重复三次，结果相似。OBC、Cal B和BAL介导的一锅级联催化方案如图6g所示。一锅级联反应的催化效率随时间变化如图6h所示，反应后乳液体系的CLSM图像见插图（比例尺：20 μm）。该实验独立重复三次，结果相似。制备了5 L放大乳液并进行催化反应（图6i）。获得约7.5 g纯化苯偶姻（图6j）。图6b–d、f和h的结果为三次平行实验的平均值，误差棒代表三次平行测量的标准差，n = 3。
全细胞回收与可持续催化
研究者展示了全细胞回收方案（图7a）。回收前Pickering乳液的CLSM液滴形态（左侧上方）和回收后cell@OBC形成的新乳液（右侧上方，比例尺：20 μm）如图7b所示；回收前后的乳液均由过表达GFP蛋白的cell@OBC稳定（下方）。该实验独立重复三次，结果相似。经过5次回收的cell@OBC在单步和级联催化中仍保持高催化活性（图7c）。不同回收次数后cell@OBC的相对菌落数（图7d），插图为不同回收次数后cell@OBC的平板培养结果。天然细胞（灰色）、新鲜cell@OBC（绿色）和回收cell@OBC（黄色）的细胞生长曲线如图7e所示。数据以平均值±SD表示，基于n = 3个独立重复，误差棒代表SD。新鲜cell@OBC的代表性cryo-TEM图像及细胞结构的放大细节如图7f所示。回收cell@OBC的代表性cryo-TEM图像及细胞结构的放大细节如图7g所示。从Pickering乳液体系中回收光催化剂的方案展示如图7h所示。分子动力学模拟用于评估主体与多个客体分子的相互作用和键合过程（图7i）。两个客体与主体分子之间的径向分布函数如图7j所示。两种不同主客体相互作用体系的平均能量如图7k所示。回收前乳液的CLSM图像和OBC与新鲜细胞形成的新乳液的CLSM图像（上方）如图7l所示；前一乳液和新乳液液滴的三维CLSM图像见下方。该实验独立重复三次，结果相似。回收后新乳液进行了四次单步催化反应和一次级联催化反应，以强调催化策略的可持续性（图7m）。
讨论与解读
本研究通过可调超分子表面化学策略，成功构建了基于活细胞Pickering乳液的界面生物催化平台。核心创新在于利用β-环糊精主体与油基光催化剂客体之间的主客体包合作用，将化学催化剂非共价锚定在大肠杆菌表面，形成两亲性"超细菌"。该设计实现了三个关键突破：其一，表面修饰显著增强了细胞对热、有机溶剂和紫外线的耐受性——45 °C处理2小时保留69.6%活性（较天然细胞提高2.4倍），甲苯-水界面应激下活性保持52.2%（提高2.8倍）；其二，界面催化使反应速率较传统双相体系最高提升45倍；其三，动态超分子连接实现了按需双模式回收——活细胞偶联物可重复使用至少5次，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞。研究还展示了从单步到序贯、一锅级联的多种催化模式，并成功放大至5 L体系获得约7.5 g纯化苯偶姻。
编译者解读
该研究代表合成生物学与绿色催化交叉领域的创新范式。将化学光催化剂通过超分子化学"即插即用"地锚定在活细胞表面，巧妙规避了化学催化剂与生物催化剂不相容的经典难题，同时保留了活细胞的自修复和自复制能力。双模式回收策略直击工业催化中催化剂成本与可持续性的痛点。值得关注的是，该平台具有高度模块化特征——更换过表达酶即可扩展反应类型，更换客体分子即可引入新催化功能。局限在于当前表面修饰的精确均一性控制仍有提升空间，且放大过程中界面稳定性对水油比的敏感性需进一步优化。该策略为构建"化学-酶"杂合催化体系提供了可推广的通用平台。
参考来源
Wu X, Dimde M, Karring H, Wang Z, Wu C. Assembly-Line Biosynthesis in Living-Cell Emulsions via Tunable Supramolecular Surface Chemistry. Nat Commun. PMID: 42342679.
PMID: 42342679