来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是达玛烷型皂苷的脱水衍生物，具有宝贵的生物活性，但栽培人参中并不天然产生。本研究组装了染色体级别的东北刺人参（Oplopanax elatus）基因组，发现其叶片积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架——却不产生RK型人参皂苷。通过比较基因组学和生化分析，研究鉴定出OeOSC14为特化的达玛二烯醇合酶，并揭示其通过祖先多功能三萜合酶的复制和新功能化演化而来。单个N260Y氨基酸替换即可将OeOSC14从达玛二烯醇特异性酶逆转回多功能三萜合酶。在烟草中重构完整通路，实现了人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类重要的特化代谢物，以C30骨架为核心并带有糖基修饰，已报道结构超过20,000种。它们既在生态层面发挥防御害虫和病原体、塑造根际微生物组等功能，又具有免疫调节、抗炎和抗癌相关药理活性。人参属植物中的人参皂苷、甘草中的甘草酸、皂树中的QS皂苷等，使三萜皂苷成为代谢工程和合成生物学的重要靶标。
栽培人参含有数百种结构各异的人参皂苷单体，主要基于达玛烷骨架，在C-3、C-6和/或C-20位发生不同糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其特征是达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，疏水性较母体化合物增强。与新鲜人参组织中占主导的普通人参皂苷不同，RK型人参皂苷在栽培人参中基本不存在，通常通过热处理或酸处理（如红参加工中的蒸制过程）获得，此过程中发生逐步脱糖基化和脱水反应。东北刺人参作为人参的近缘物种，积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架——却不产生RK型人参皂苷，这为研究三萜骨架多样化的演化机制提供了独特材料。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用的健康东北刺人参个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。该种群栽培于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘保持根系完整，快速清洗后立即投入液氮冷冻，随后保存于−80 °C备用。各组织类型的具体外观如图1B所示。使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为生成PacBio HiFi长读长数据，共取15 µg高分子量（HMW）DNA，使用gTUBEs剪切，随后用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库使用BluePippin系统进行大小选择，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi共有序列在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程，Hi-C文库定量后在MGIseq-2000测序平台上测序。
基因组从头组装与质量控制
东北刺人参基因组使用PacBio HiFi reads结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3过滤原始Hi-C数据以获得高质量clean reads（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。使用hifiasm v.0.16.1将HiFi CCS reads组装为单倍型分型的contigs，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定到染色体上，利用Juicer v.1.65和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）对contigs进行过滤、排序和定向。最后，使用Juicebox v.1.11.08手动修正组装，纠正错误连接并进一步优化contig顺序和方向，最终获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用了从头预测和同源性比对相结合的策略。首先，使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。然后应用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。对于基于同源性的鉴定，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外，使用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组内的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果，包括总重复含量和详细家族组成，见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：基于同源性的预测、从头预测和基于RNA-seq数据的转录组预测。对于基于同源性的预测，使用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）将近缘物种的蛋白质序列比对到组装基因组。然后使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）识别最佳比对结果和相应基因结构。在从头预测中，首先使用RepeatMasker屏蔽基因组中的重复区域。然后利用同源性方法预测的基因结构训练HMM模型。随后使用Augustus v.3.5.0基于训练的HMM模型预测基因结构。对于基于转录组的预测，首先使用HISAT2 v.2.2.1将RNA-seq数据比对到基因组。使用StringTie v.2.2.0将比对读段组装为转录本。使用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并进一步优化转录本模型。最后，使用MAKER2整合三种方法预测的基因模型，生成高质量基因集。对于功能注释，使用BLASTP（E值<1e-10）将预测基因的蛋白质序列比对到SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库。基于最佳BLASTP命中结果分配功能注释。
基因组演化分析
使用东北刺人参和另外18种植物进行比较基因组分析：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类基因家族。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取phase 1或四倍简并（4D）位点。随后使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然（ML）系统发育树，1000次bootstrap重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。进一步使用单拷贝直系同源基因的四倍简并位点，通过PAML v4.9j包中的MCMCTree程序估算物种分化时间。分化时间在贝叶斯框架下使用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree中使用以下参数：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分化时间。基因家族扩张和收缩使用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，首先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，使用PAML中的codeml在F3X4模型下计算每个共线性区块内基因对之间的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排名选择最佳命中基因对，使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT），使用HMMER v.3.1b2在东北刺人参中进行基因家族预测，E值阈值<0.01。使用SeqKit v2.6.1软件根据长度进一步过滤预测的蛋白质序列：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员随后使用在线工具保守结构域数据库进行验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT等基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列与东北刺人参中预测的家族成员进行系统发育分析。分析中使用的所有序列列于补充数据3–6。使用MAFFT v.7.518以默认参数进行多序列比对。使用FastTree v.2.74软件在默认设置下重建最大似然（ML）系统发育树。所得Newick格式树使用Interactive Tree Of Life（iTOL）在线平台可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant RNA Kit提取总RNA。载体构建及后续实验步骤详见原文补充材料。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，先前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，研究人员对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢物分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物的总离子流色谱图（TICs）和m/z 189提取离子流色谱图（EICs）显示，在37.15分钟处有一个显著的未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法据此进行结构鉴定（图1D）；因此，研究人员对叶片中的P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱测定其结构，鉴定为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，使用市售的人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3标准品进行靶向LC-MS分析。在东北刺人参的叶片或任何其他检测组织中均未检测到这三种人参皂苷（图1E-G和补充图9）。综上，这些发现表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在不同组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组的测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，研究人员生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参的单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率为8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi reads和126.91 Gb（约71×）Hi-C reads用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含两个单倍型，锚定到24条假染色体上，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，预测了61,842个高置信度蛋白质编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6-9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的演化历史和东北刺人参的系统发育位置，研究人员分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高度支持的分支：一个包含刺五加和东北刺人参，另一个包含辽东楤木和5个人参属物种。这一拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B形成两个独立分支，分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚类，这与涉及两个分化祖先谱系的共享异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种中也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能来源于一个类似二倍体五加科的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群组的MCMCTREE分化时间估算（使用TimeTree的化石校准）将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，随后五加科两个主要谱系的分化约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参的亚基因组A和B约在23.2百万年前分化，早于辽东楤木-人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种的基因组，以获得在东北刺人参中显著扩张或东北刺人参特有的基因家族。GO和KEGG富集分析表明，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度代表，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。因此，研究人员分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与葡萄之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种表现出二倍体物种中不存在的约0.1处的额外Ks峰。每个异源四倍体内部两个亚基因组之间的直系同源基因对也显示出约0.1处的峰。与此模式一致，共线性分析揭示了葡萄、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科中发生在共享五加科WGD之后的相对近期异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，研究人员假设东北刺人参基因组编码一种氧化鲨烯环化酶（OSC），特异性催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛二烯醇。为验证这一假设，使用已知的人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白质后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
通过系统发育分析，OeOSC14与已知的达玛烯二醇合酶（DDS）聚在一起。为验证OeOSC14的功能，研究人员在烟草叶片中瞬时共表达OeOSC14与tHMGR（截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶），通过GC-MS分析检测到达玛二烯醇的产生。OeOSC14特异性产生达玛二烯醇，而不产生其他三萜产物，表明其是达玛二烯醇特异性合酶。
OeOSC14的演化与功能切换
多序列比对显示，OeOSC14在第260位具有天冬酰胺（N），而其他多功能三萜合酶在该位置通常为酪氨酸（Y）。为验证该位点的功能意义，研究人员构建了OeOSC14的N260Y突变体。GC-MS分析表明，OeOSC14 N260Y突变体从达玛二烯醇特异性酶转变为多功能三萜合酶，产生包括β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II在内的多种产物。相反，将多功能合酶SbχAS的Y259N突变后，其从多功能转变为达玛二烯醇特异性酶。分子对接模型进一步揭示了该位点对产物特异性的结构基础。
RK型人参皂苷生物合成通路的解析与重构
为阐明东北刺人参中RK型人参皂苷生物合成的缺失原因，研究人员分析了C-12羟化酶基因。系统发育分析显示，东北刺人参中的CYP716A47直系同源基因（OeCYP）可能因功能丧失突变而失活。跨物种共线性分析进一步证实了该基因座的缺失。
为在植物中重构RK型人参皂苷的生物合成，研究人员在烟草中瞬时共表达tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2，成功检测到原人参二醇的产生。进一步共表达UGT基因后，通过LC-MS检测到人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头合成。
讨论与解读
本研究通过染色体水平的基因组组装和比较基因组学分析，揭示了东北刺人参中达玛二烯醇合酶OeOSC14的演化机制——其通过祖先多功能三萜合酶的复制和新功能化而产生。单个N260Y氨基酸替换即可实现达玛二烯醇特异性酶与多功能酶之间的功能切换，这一发现为三萜合酶的产物特异性机制提供了精确的分子解释。研究同时阐明了东北刺人参不产生RK型人参皂苷的原因——C-12羟化酶的功能丧失阻断了关键的下游氧化步骤。在烟草中成功重构完整通路，实现了人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头生产。
编译者解读
该研究展示了"基因组挖掘—演化分析—通路重构"的完整策略在植物天然产物合成生物学中的应用价值。通过解析近缘物种中前体积累但终产物缺失的分子机制，精准定位了限速步骤和失活位点，为在其他植物底盘（如烟草）中异源生产RK型人参皂苷提供了清晰的路线图。单氨基酸切换酶功能的发现也为三萜合酶的理性设计提供了新靶点。值得注意的是，烟草瞬时表达系统虽验证了通路可行性，但规模化生产仍需稳定转化和产量优化。未来可将该策略推广至其他稀有活性人参皂苷的微生物或植物底盘生产。
PMID: 42342661