来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
把一段向导RNA装进CRISPR质粒，传统做法离不开限制性内切酶和连接酶。2025年发表于《STAR Protocols》的一项工作，把这一步简化成了普通PCR扩增。美国研究者开发了一套基于PCR片段直接插入的酿酒酵母CRISPR-Cas9编辑流程，省去酶切连接，向导迭代只需换一对引物。
这套方案的意义在于：当你要同时测试几十条向导RNA的切割效率时，传统克隆方式会成为瓶颈。PCR扩增一个带有同源臂的向导表达盒，再通过同源重组装进Cas9质粒，整个流程在一天内完成质粒构建，而无需依赖任何限制性内切酶位点。论文通讯作者来自美国国家癌症研究所（NCI），研究团队将完整操作流程发表在STAR Protocols上，为酵母基因编辑提供了一份可复制的实验手册。
研究背景：酵母基因编辑的“最后一公里”瓶颈
酿酒酵母是合成生物学最常用的底盘生物之一。CRISPR-Cas9系统在酵母中高效工作，但向导RNA的递送方式长期依赖限制性内切酶酶切和连接酶连接。这种做法需要为每个向导设计独特的酶切位点，遇到甲基化敏感的内切酶或复杂模板时，克隆效率会急剧下降。更麻烦的是，当需要大规模筛选向导文库时，酶切连接的低通量特性会让整个项目寸步难行。
PCR产物直接同源重组进入质粒，在细菌中早已是常规操作。但在酵母编辑场景中，向导RNA表达盒需要精确插入Cas9质粒的特定位置，同时保持质粒骨架完整，这要求PCR引物设计足够严谨。本方案的核心思路是：用PCR扩增带有长同源臂的向导表达盒，转化大肠杆菌后利用体内同源重组完成质粒环化，一步得到完整的Cas9-sgRNA共表达质粒。这种做法把向导构建从“克隆”变成了“PCR+转化”，操作门槛大幅下降。
研究方法：从PCR扩增到酵母共转化
整个流程分为四个模块：向导RNA和供体DNA设计、PCR产物构建质粒、大肠杆菌中验证、酵母共转化筛选。每一步都给出了精确的试剂配方和操作参数。
培养基配制是第一步。 LB液体培养基（含卡那霉素）配方为：LB肉汤粉末25 g/L，加ddH2O定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟（液体循环），冷却至约55°C后加入无菌过滤的卡那霉素储液（50 mg/mL）1 mL，终浓度50 μg/mL。不加抗生素的LB液体培养基室温可保存6个月，加卡那霉素的4°C保存1个月。LB琼脂板（含卡那霉素）在液体配方基础上加Bacto琼脂15 g（1.5% w/v），灭菌后冷却至55°C加入卡那霉素1 mL，轻摇混匀避免气泡，倒入无菌培养皿，室温凝固后倒置，4°C保存最多1个月。
酵母培养基同样有精确配方。YPD液体培养基：葡萄糖10 g（2% w/v）、蛋白胨10 g（2% w/v）、酵母提取物5 g（1% w/v），ddH2O定容至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温可保存6个月。YPD琼脂板（含G418）在液体配方基础上加Bacto琼脂10 g（2% w/v），灭菌后加入G418储液（50 mg/mL）5 mL，终浓度500 μg/mL。
质粒构建的核心步骤是PCR扩增向导表达盒。 研究者设计了带有同源臂的引物，同源臂序列与Cas9质粒上预期插入位点两侧的序列一致。PCR产物直接转化大肠杆菌，利用细菌体内的同源重组机制，将向导表达盒精确插入质粒，同时实现质粒的环化——这一步替代了传统的酶切和连接。转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的LB平板上，由于Cas9-sgRNA质粒带有KanMX筛选标记，只有成功重组的克隆才能存活。挑取单克隆后，通过菌落PCR和测序验证向导序列是否正确插入。
酵母转化采用醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）共转化法。 将验证正确的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA同时转化酵母感受态细胞。LiAc处理使酵母细胞壁通透性增加，PEG促进DNA黏附到细胞表面，热激促进DNA摄取。转化后细胞在YPD培养基中恢复培养，然后涂布到含G418的YPD平板上筛选。G418（Geneticin）与卡那霉素同属氨基糖苷类抗生素，KanMX基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶能使酵母获得G418抗性，从而筛选携带Cas9-sgRNA质粒的转化子。
对照设计是关键。 研究者强调必须设置“无供体对照”（-HDR donor），即只转化Cas9-sgRNA质粒而不加供体DNA。这个对照的意义在于：Cas9切割基因组DNA是致死的，如果没有供体DNA提供修复模板，细胞只能通过易错的非同源末端连接（NHEJ）修复，大多数情况下修复失败导致细胞死亡。因此，无供体对照组应该长出很少的菌落，而实验组（加供体DNA）长出大量菌落。这种“多对少”的对比是判断向导RNA切割效率的初始指标。
研究结果：菌落对比揭示切割效率，菌落PCR验证编辑事件
转化后30°C培养2–3天，实验结果的判读非常直观。加入HDR供体的条件下，YPD+G418平板上通常长出大量菌落；而不加供体的对照组只长出极少数菌落。这种鲜明对比说明两件事：第一，转化和筛选体系工作正常；第二，所选向导RNA在目标位点能够高效切割。如果对照组也长出大量菌落，则提示向导RNA切割效率低下或脱靶活性异常。
下游验证环节，研究者推荐挑取6–8个菌落进行菌落PCR。引物设计在供体同源臂外侧，这样只有正确整合的编辑事件才能扩增出预期大小的条带。对于缺失或插入突变，编辑克隆的PCR产物应相对未编辑对照出现明显的条带位移；对于点突变，则需要通过DNA测序确认。成功的实验中，至少有一部分筛选菌落PCR阳性，测序结果应确认设计的基因型，包括供体DNA中引入的沉默PAM突变——这种突变破坏Cas9识别位点，防止编辑后被再次切割。
质粒丢失是流程的最后一步。编辑成功的克隆在非选择性培养基（YPD）中传代培养后，部分细胞会自然丢失KanMX标记的Cas9质粒。通过同时在YPD和YPD+G418平板上划线，可以在YPD上生长但在G418平板上不生长的菌落即为已丢失质粒的“治愈”克隆。这一步对后续实验很重要——如果你要在编辑菌株中做第二轮编辑，必须先去除第一轮的Cas9质粒。
讨论与展望：快在哪里，限制在哪里
这套方案最直接的收益是向导迭代速度。传统酶切连接流程从设计引物到获得质粒通常需要3–4天，本方案将质粒构建压缩到1天。PCR产物的同源臂长度和退火温度是决定重组效率的关键参数，论文在讨论中强调了引物设计时同源臂长度应覆盖足够长的序列以确保重组效率。此外，由于整个流程不依赖限制性内切酶位点，理论上任何向导序列都可以直接克隆，不受酶切位点可用性的限制。
局限同样存在。PCR扩增长片段时的保真度、大肠杆菌体内重组对大片段插入的效率限制，都可能影响复杂文库构建。对于需要同时递送多个向导RNA的多重编辑场景，本方案需要额外设计多表达盒载体。不过，就单基因编辑和中小规模向导筛选而言，这套方法提供了一个简单、快速且成本可控的选择。研究者将完整操作流程发表在STAR Protocols上，意味着这套方法经过了严格的实验验证，可复现性有保障。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protoc. 2025. PMID: 42519825.
PMID: 42519825