来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
第二代生物乙醇的产业化进程高度依赖高效纤维素酶的可及性。本研究以甘蔗渣与麦麸为固态基质，在多层填充床生物反应器中系统评估了嗜热真菌嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila I-1D3b）在批式与连续两种操作模式下的内切葡聚糖酶集成生产、提取、回收与稳定化工艺。结果显示，连续操作在保持平均酶活（96.36 U·g.d.s⁻¹）的同时显著降低了模块间差异，硫酸铵沉淀实现78.7%的酶活回收率，为纤维素酶原位生产提供了一条完整的技术路径。
研究背景
循环生物经济理念推动有机副产物向能源与高值生物产品转化，木质纤维素生物精炼因此成为关键平台。第二代生物乙醇的经济可行性高度依赖高效的纤维素酶系——目前商品酶制剂成本居高不下，严重制约了产业化进程。原位产酶策略旨在降低对外部酶制剂的依赖，提升生物精炼厂的酶自给能力。固态发酵（SSF）凭借可直接利用农工副产物、用水量低等优势，成为酶生产的重要平台。在各类反应器构型中，填充床系统结构简单、放大潜力大，但传热效率差、床层过热、下游处理困难等问题始终是其规模化应用的瓶颈。本研究针对这些关键限制因素，以甘蔗渣和麦麸（7:3 w/w）为基质，在多层填充床反应器中系统考察了批式与连续操作对酶生产、提取与回收全过程的影响。
研究方法
微生物与基质
产酶菌株为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b，最初分离自巴西Usina Guarani（Olímpia, SP, Brazil）的甘蔗渣堆，前期摇瓶与反应器实验已证实其具有优异的纤维素酶生产能力。
孢子接种物制备：菌株在含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的锥形瓶中斜面培养，置于生化需氧量培养箱（BOD，型号SL 200，Solab，巴西）中，45 °C培养至少48 h以完成菌丝生长与产孢。随后用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面孢子。该营养液pH调至5.0，成分组成（w/v）为：0.35% (NH₄)₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化至每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固态基质选用甘蔗渣（SCB）与麦麸（WB），二者成本低、区域供应充足，且能为固态基质提供有利的营养与结构条件。SCB由Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.（巴西）供应，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro, São Carlos, SP, Brazil）。SCB先在鼓风干燥箱（型号035，Marconi，巴西）中60 °C干燥至含水量10–15%（水分分析仪测定，M5 Thermo，Bel Engineering，Monza，意大利），干燥后过筛（5 × 5 mm和4 × 2 mm网孔）。麦麸直接使用，含水量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床生物反应器中的固态发酵
固态发酵实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，实现床层温度控制并缓解填充床SSF中常见的过热现象。
工艺空气由压缩机供给，依次通过针阀、生物过滤器、AppliTech®流量计（Asa，意大利），随后进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间隙充满蒸馏水并维持在操作温度，使空气在进入反应器前达到饱和状态——该策略旨在最大限度减少SSF过程中床层过度干燥。反应器出口处，渗透气体通过除湿系统，该系统由连接接收瓶的冷凝液收集器与硅胶柱（直径5.2 cm、高39 cm）组成。该装置将出口空气相对湿度降至15%以下，这是使用Vaisala Carbocap探头（Vantaa，芬兰）准确测量CO₂浓度的必要条件。
反应器垂直放置，包含入口模块（IL）与出口模块（OL），二者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部为锥形几何结构。运行期间空气自下而上流过固定床。位于系统底部的入口模块（IL）填充玻璃珠以促进气流均匀分布，出口模块（OL）则保持空置以利于气体流动。此外，两个辅助模块分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）与干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块中水分的过度去除并吸收出口模块壁面冷凝的水分。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持在45 °C——该温度已被报道为 M. thermophila 产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验期间工艺空气与循环水均通过模块和加湿器夹套中的水循环维持在45 °C，由恒温水浴（型号SL-152，Solar，巴西）供给，渗透空气流量固定为250 L h⁻¹以增强氧气传质并维持整个床层适宜的湿度条件。
发酵温度曲线通过安装在每个发酵模块进出口法兰上的T型热电偶随时间监测。传感器尖端位于各模块径向中心，可监测整个发酵过程中床层内部温度的变化。信号由National Instruments COMPAQ-DAQ数据采集系统记录，运行基于LabVIEW软件（National Instruments，Austin，USA）开发的控制程序。
模块的添加、移除与重新定位过程中，固体基质会暂时暴露于实验室环境。但所有操作均在无菌条件下进行以最大程度减少微生物污染。基质与营养液分别在121 °C高压灭菌20 min。冷却后在经紫外辐射灭菌的层流柜中将各组分与孢子悬浮液混合均匀。空气过滤器与加湿装置在每次发酵前同样经过灭菌处理。
发酵培养基采用SCB与WB按7:3（w/w）比例混合。含水量通过添加营养液与接种物悬浮液调节至75%（湿基），接种量足以提供每克干固体1 × 10⁷个孢子。每个发酵模块填充130 g干基质。
操作模式
为评估操作模式（批式与连续）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，连续操作分为上行与下行两种模式。批式培养中，PBB在发酵开始时即组装全部发酵模块，并保持同一构型直至96 h终点，该条件作为与连续模式实验比较的参考。4天发酵使用4个发酵模块，分别标记为L1、L2、L3和L4。
连续模式下，模块每24 h依次添加，经历接种、装填、耦合至PBB的步骤序列。初始阶段床高逐步增加，直至首个插入模块达到规定停留时间。此后进入稳态操作，特征为发酵完成模块的移除与新接种模块的添加同步进行。模块运动方向依据操作策略不同而分为上行（底部进料、顶部出料）或下行（顶部进料、底部出料）。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控是填充床生物反应器操作的主要技术挑战之一，代谢热积累可能损害酶稳定性与发酵过程的均一性。本研究考察了批式与连续操作模式对 M. thermophila I-1D3b在木质纤维素基质（SCB:WB，7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3展示了批式操作（图3a）、上行连续操作（图3b）与下行连续操作（图3c）下四个发酵模块的温度时间演变。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度保持在45 °C附近，各监测点间差异小于4 °C。批式操作下，初始温度升高，随后出现热峰并趋于稳定或略有下降——该行为与固定床系统中代谢热的瞬态积累一致。轴向温度梯度的形成与单向通气内在相关，表现为沿反应器长度方向的温度离散。尽管过热程度较轻，梯度的持续存在仍可能影响床层内的氧传质与蒸发速率。
连续操作下（图3b与3c），热曲线比批式模式出现更频繁的振荡，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在波动，温度仍保持在批式操作观察到的相似范围内，未见明显的热过热现象。在96至210 h之间，每24 h添加与移除一个模块，系统以模块沿柱体连续推进的方式运行，行为接近活塞流反应器。该解释与Mitchell等人的观点一致——连续PBB操作可促进床层内过程条件的更大均匀性。各操作模式下的最高温度与平均温度相近，峰值分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上行连续）与47.8 ± 0.8 °C（下行连续），平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4与44.5 ± 0.5 °C，差异均无统计学意义（p > 0.05）。结果表明，在评估条件下两种操作模式均使系统保持在目标热范围附近，未出现严重过热。
温度维持在接近最适范围的这一结果提示，高床层孔隙率、嗜热微生物的选用与模块移动策略的组合有利于代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等人在含甘蔗渣与麦麸系统中报道的数值——后者在孔隙率0.55下观察到约3 °C的温升。相比之下，Ghildyal等人在PBB中培养黑曲霉于麦麸上时报道了15 °C的温升。这些比较共同证实，床层的物理结构在固态发酵的热消散与热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置同样影响反应器热曲线。图3c展示了新鲜接种模块从反应器上部加入时的连续发酵热行为。在该构型下，热峰集中在PBB上部区域，与图3b中最高峰出现在床层下部与中间区域的曲线形成对比。该差异表明新接种模块所处位置直接影响系统内热量的空间分布。图3c中每24 h记录到的温度下降反映了模块添加、移除与移动的时刻，表征了连续操作中的间歇性特征。由于新模块从发酵区上部插入，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间推移热变化较小。该行为表明模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，因此在系统操作设计中应予以考虑。然而，受下游系统集成相关的操作限制，本研究后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
内切葡聚糖酶活与发酵模块的最终含水量在批式与上行连续操作下进行了评估，结果如图4与表1所示。对这些变量的控制对PBB性能至关重要，因为低于10%的水热梯度可能使酶生产率降低30–50%。批式与连续操作的平均内切葡聚糖酶活相近，分别为95.63 ± 28.37与96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管平均值相近，连续过程中观察到的较低离散度表明各发酵模块间酶活的空间均一性更高。因此，两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性而非平均产酶水平。
连续操作下的这种均匀性与批式模式下观察到的更大离散度形成对比——批式模式的离散可归因于静态系统特有的局部水分、温度与氧可用性异质性。从操作角度看，连续模式代表了更高的过程稳健性与可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间推移均暴露于热梯度和湿度梯度的所有区域。根据Mitchell等人的观点，连续操作下PBB倾向于接近活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相与热条件。这些结果与Rodrigues等人在相同基质（SCB:WB 7:3 w/w）上使用 M. thermophila I-1D3b于PBB中进行连续发酵时观察到的内切葡聚糖酶活更高均匀性一致。
除酶活外，床层含水量同样是系统的关键方面，因为水分含量的降低直接损害SSF中真菌的生长与代谢活性。固体基质最终含水量（湿基%）见表1。
讨论与解读
本研究证实，以甘蔗渣与麦麸为基质，M. thermophila I-1D3b在多层填充床生物反应器中以批式与连续两种操作模式进行固态发酵产内切葡聚糖酶在技术上可行且可重复。连续操作降低了床内异质性，促进了各发酵模块间酶活的高度均匀性，且未牺牲相对批式操作的平均产量水平。热曲线保持在物种最适范围附近，最高温度分别为48.2 °C（批式）与48.9 °C（连续），表明连续操作未损害系统稳定性。在评估的浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优异，从粗提液中实现78.7%的总酶活回收率，酶活达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在测试条件下导致显著的酶活损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，在60 °C下孵育24 h后仍保留约92%的活性。综合来看，热控制、渗透提取与下游处理的集成对于该平台在第二代乙醇链中原位生产纤维素酶的稳健性与适用性至关重要。
编译者解读
该研究的技术亮点在于将反应器操作模式（连续化模块推进）与下游回收策略（渗透提取+硫酸铵沉淀）作为一个整体系统进行优化，而非孤立优化单一环节。连续模式将模块间酶活变异系数从批式的近30%降至约5%，这对工业放大的过程可控性意义深远。硫酸铵沉淀78.7%的回收率与60 °C下24 h保留92%活性的热稳定性数据，为酶制剂的低成本浓缩与常温稳定化提供了可直接参考的工艺窗口。值得关注的是，乙醇沉淀在本研究中表现不佳——这提示醇沉策略在含糖类复杂基质背景中的适用性需要重新审视，而非想当然地将其作为通用浓缩方案。后续研究若能在中试规模验证连续模式的长期运行稳定性，并探索沉淀后酶的纯化与配方化，将推动该平台向工业化迈出实质性一步。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. Bioprocess Biosyst Eng. PMID: 42370983.
PMID: 42370983