来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
一株以甲醇为唯一碳源的工程化Komagataella phaffii（毕赤酵母）菌株，通过三模块代谢平衡和蛋白质工程改造，将尿黑酸产量提升66倍，并在5升发酵罐中实现70.5 g/L的黑素酮（pyomelanin）最高产量。这项发表在Nature Communications上的工作，同时建立了基于颜色的高通量筛选系统，为黑素酮的工业化生产提供了一条完整的技术路径。
黑素酮是一种天然黑色素家族成员，在光电子、生物材料、环境修复等领域应用广泛。然而，从天然产生菌中直接提取，产量低、成本高，难以满足工业需求。微生物细胞工厂合成被视为可持续且经济可行的替代方案。该研究选择甲醇营养型酵母K. phaffii作为底盘生物——这种酵母能以甲醇为碳源，且蛋白表达系统成熟，遗传操作工具完善。研究团队的核心策略是：先通过代谢工程大幅提升尿黑酸（HGA）——黑素酮的直接前体——的产量，再通过氧化聚合反应将HGA转化为黑素酮。这一思路绕开了天然产生菌产量低的瓶颈，把黑素酮生产转化为一个可放大的发酵工程问题。
研究背景
黑素酮的化学本质是尿黑酸的氧化聚合产物。天然产生菌如铜绿假单胞菌、黑曲霉等虽然能够合成黑素酮，但产量普遍偏低，且菌株遗传背景复杂，难以进行系统性代谢工程改造。合成生物学的发展使得在模式微生物中重构黑素酮生物合成途径成为可能。K. phaffii（原Pichia pastoris）是工业上广泛使用的蛋白表达宿主，具备甲醇诱导的强启动子（如AOX1），高密度发酵工艺成熟，且其自身就携带尿黑酸合成的内源途径。然而，野生型菌株的尿黑酸产量极低，关键酶的催化效率不足，这成为整个合成路径的瓶颈。该研究的出发点正是针对这些瓶颈酶进行改造，同时通过多拷贝整合和发酵工艺优化，把黑素酮产量推向工业化水平。
研究方法
菌株与质粒构建
研究以K. phaffii GS115（Invitrogen）为宿主菌，Escherichia coli TOP10F'（Invitrogen）用于质粒构建与扩增，E. coli BL21(DE3)（Sangon Biotech）用于蛋白表达。为保障遗传稳定性，基因过表达整合采用pZACH质粒，并通过Cre/loxP ZeoR标记循环回收系统确保每次整合的稳定性。基因敲除使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达与纯化使用pET-28a质粒。异源酪氨酸转氨酶（TYRB）和羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）的编码基因经密码子优化后由Generay（上海）合成。所有菌株、质粒、引物序列及整合位点信息均列于补充数据中。
培养基与培养条件
E. coli菌株在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37 °C培养。重组酵母菌株分别在YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）或BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）中培养。摇瓶发酵用于途径构建和筛选，5升发酵罐用于高密度发酵。
代谢途径模块化构建
研究将尿黑酸生物合成路径划分为三个模块：上游模块负责芳香族氨基酸前体供应，中游模块包含异源TYRB和HPPD催化L-酪氨酸转化为尿黑酸，下游模块则是尿黑酸的氧化聚合。三个模块的平衡通过启动子强度、基因拷贝数和整合位点协同调控。具体而言，研究首先测试野生型菌株的尿黑酸合成能力，随后在培养基中补充不同浓度的L-酪氨酸以评估前体限制效应。接着，从不同物种来源筛选HPPD和TYRB基因，确定Alcaligenes faecalis来源的HPPD和Yarrowia lipolytica来源的TYRB为高效候选。对关键酶AfHPPD进行多拷贝整合——将三个拷贝分别整合到HIS4、INT1和INT18三个基因组位点，获得菌株Pyo9。在此基础上，进一步组合优化三个模块的拷贝数与表达水平，最终获得高产菌株Pyo29。
黑素酮颜色筛选系统与蛋白质工程
基于尿黑酸自氧化聚合产生色素的现象，研究建立了以OD400吸光值为指标的颜色筛选系统。该系统用于两轮蛋白质工程改造：一是对3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHPS）进行定向进化，以增强上游芳香族氨基酸途径的碳通量；二是对羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）进行半理性设计改造，提升其催化效率。具体突变策略和筛选轮次——原文摘要未详述具体参数，但明确了该系统能够通过培养液颜色变化直观反映尿黑酸产量，从而实现高通量筛选。
黑素酮聚合与表征
尿黑酸向黑素酮的转化通过两种方式实现：碱性条件下的氧化聚合和漆酶（laccase）处理。研究对比了两种聚合方式所得黑素酮的差异。原文摘要未详述具体聚合条件参数。产物经纯化后进行表征分析。
高密度发酵
最终的高产菌株Pyo29在5升发酵罐中进行高密度发酵，发酵时长204小时。原文摘要未详述发酵过程中甲醇流加策略、pH控制、溶氧设定等具体参数。
研究结果
野生型菌株尿黑酸产量极低
野生型K. phaffii经过5天摇瓶发酵，尿黑酸产量仅为25 ± 0.85 mg/L，培养上清液未见明显颜色变化，OD400仅为0.006。向培养基中补充不同浓度的L-酪氨酸，尿黑酸产量未见显著提升。这表明内源HPPD和TYRB的催化效率是主要瓶颈。
异源酶筛选与多拷贝整合显著提升产量
从不同物种来源筛选HPPD和TYRB基因后，发现Alcaligenes faecalis来源的HPPD和Yarrowia lipolytica来源的TYRB能显著增强尿黑酸合成。相比之下，HPPD过表达对产量的提升效果大于TYRB，这与文献中HPPD是尿黑酸途径关键酶的报道一致。进一步对AfHPPD进行多拷贝整合，菌株Pyo9携带三个AfHPPD拷贝（分别整合于HIS4、INT1和INT18位点），尿黑酸产量达到64.1 ± 0.68 mg/L。与野生型相比，Pyo9的培养上清液呈现更深的浅棕色，OD400升至0.362，这归因于尿黑酸的自氧化聚合。
三模块平衡实现66倍产量提升
通过平衡三个不同生物合成模块——上游前体供应、中游异源酶表达、下游聚合转化——最终菌株的尿黑酸产量较野生型提升66倍。原文摘要未提供各模块具体拷贝数与组合方式的详细数据。产量提升的同时，培养液颜色随尿黑酸积累而加深，为颜色筛选系统提供了直观依据。
颜色筛选系统驱动蛋白质工程
基于OD400的颜色筛选系统成功应用于DAHPS的定向进化和HPPD的半理性设计。原文摘要未提供具体突变位点、筛选轮数及突变体酶动力学参数。该系统利用黑素酮前体积累与色素生成的偶联关系，使研究人员无需繁琐的色谱检测即可快速评估突变体性能。
两种聚合方式产物存在差异
研究报道了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理所得黑素酮之间的差异。原文摘要未详述产物在结构、分子量分布、光学性质或抗氧化活性等方面的具体差异数据。这一发现提示，聚合条件的选择会直接影响黑素酮的最终性质，进而影响其应用方向。
5升发酵罐实现70.5 g/L产量
高产菌株Pyo29在5升发酵罐中经204小时高密度发酵，黑素酮产量达到70.5 ± 0.7 g/L。这是目前报道的黑素酮微生物合成最高产量之一。原文摘要未提供发酵过程中的生长曲线、甲醇消耗速率或产物得率等数据。
讨论与展望
这项研究的价值在于把黑素酮从一个"提取难、产量低"的天然产物，变成了一个可工程化、可放大的发酵产品。66倍的尿黑酸产量提升和70.5 g/L的黑素酮最终产量，两个数字之间隔着三模块平衡、蛋白质工程和高密度发酵三座大山——研究团队逐一翻越，每一步都留下了可复用的工具：颜色筛选系统让进化实验不再依赖昂贵检测；Cre/loxP标记回收保证了多轮整合的遗传稳定性；5升罐的204小时发酵数据则为工业放大提供了直接参考。
碱性聚合与漆酶处理产物的差异值得玩味。聚合条件不同，产物性质可能截然不同——这意味着黑素酮的下游应用不能简单套用一个标准品，而必须根据目标场景选择聚合方式。这项研究没有止步于产量数字，而是把产物的性质差异也纳入了考量，这种完整性在同类工作中并不多见。
甲醇作为碳源是另一个亮点。K. phaffii利用甲醇的天然能力，让黑素酮生产与甲醇这一廉价原料挂钩。在绿色化工和碳一生物利用的大背景下，这条技术路线有着天然的产业适配性。当然，从70.5 g/L的发酵罐产量到真正的商业化生产，中间还隔着提取纯化成本、批次稳定性、产物标准化等一系列工程问题——但至少，起点已经足够高。
参考来源
Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nature Communications. PMID: 41839868.
PMID: 41839868