来源：ACS Omega | 编译：DNA Lab Space
导语：瑞士日内瓦大学的研究团队利用云芝来源的漆酶，对三种天然产物——二氢芪类化合物gigantol和两种菲类化合物flavidin、coelonin——进行酶促生物转化。通过系统优化反应条件，他们成功分离并鉴定了13个结构多样的衍生物，其中10个为全新化合物。这项研究为天然产物的结构多样化提供了一条绿色、高效的酶催化路径。
研究背景
天然产物一直是药物发现的重要来源，但自然界提供的化合物骨架终究有限。如何在不依赖复杂化学合成的前提下，快速扩展天然产物的结构多样性，是化学生物学领域长期关注的课题。生物转化（biotransformation）凭借其温和的反应条件和环境友好特性，成为实现这一目标的有效手段之一。
漆酶（laccase）是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化酚类底物的单电子氧化，生成活性自由基中间体。这些中间体可以进一步发生偶联、加成等反应，从而形成结构更为复杂的产物。过往研究已证明，漆酶介导的生物转化能够在多种化学骨架中产生具有生物活性的新化合物。
然而，针对特定天然产物骨架的系统性漆酶转化研究仍不多见。本研究选择三种结构相关的底物——二氢芪类化合物gigantol以及两种菲类化合物flavidin和coelonin——作为研究对象，旨在考察漆酶能否在这些骨架上创造出新的化学多样性。这三种底物均来自兰科植物，具有潜在的生物活性，但结构修饰空间尚待开发。
研究方法
实验材料与试剂来源
研究使用的三种底物均为纯化合物。Gigantol（CAS: 83088-28-2）购自法国Extrasynthese公司；flavidin（CAS: 83924-98-5）和coelonin（CAS: 82344-82-9）购自中国湖北ChemFaces公司。催化用的云芝（Trametes versicolor）漆酶（CAS: 80498-15-3）则购自德国Merck公司。
分析仪器与波谱条件
紫外光谱在HACH UV–vis DR/4000仪器上测定。核磁共振（NMR）数据由配备QCI 5 mm低温探头和SampleJet自动进样系统的Bruker Avance Neo 600 MHz波谱仪采集。化学位移以残留的DMSO-d₆溶剂峰为内标（¹H δ 2.50；¹³C δ 39.5），耦合常数J以Hz为单位记录。结构的确证基于二维NMR实验，包括COSY、ROESY、HSQC和HMBC。
分析规模生物转化反应
生物转化反应在2 mL Eppendorf管中进行，每次仅转化一种底物。反应总体积为0.5 mL，底物以乙醇溶解，终浓度为1 mg/mL，即每管含500 μg底物。漆酶最后加入，用量为30 μL、浓度12.5 U/mL的水溶液。反应体系中乙醇占比10%，丙酮最高可达60%，水相占30%至90%（体积比）。
反应混合物配制完成后，置于室温、避光条件下，持续温和振荡。反应时间根据实验设计为3至9小时不等。到达预定时间后，用500 μL乙酸乙酯萃取反应液。有机相经氮气流干燥，最终以200 μL甲醇复溶，供超高效液相色谱分析。
条件筛选与放大
分析规模的反应条件筛选覆盖了较宽的参数范围。有机溶剂浓度在10%至70%之间变化，漆酶母液浓度在10至100 U/mL之间调整。反应进程通过UHPLC-PDA-ELSD-MS监测，以底物信号显著下降和质谱基峰离子（BPI）色谱图中出现多个新峰作为反应发生的判断标准。
放大反应使用20至50 mg底物，反应体系体积为5至10 mL，监测条件与分析规模一致。待底物消耗完全后终止反应，粗产物混合物经高效半制备液相色谱纯化，采用干法上样（dry-load injection）技术。最终分离得到的衍生物逐一进行高分辨质谱（HRMS）和NMR波谱表征。
研究结果
gigantol的生物转化
在gigantol（化合物1）的生物转化条件筛选中，研究人员发现，当有机溶剂比例为30%、漆酶溶液（12.5 U/mL）用量为30 μL、室温孵育9小时时，质谱检测到大量新特征峰。这些信号对应着羟基化衍生物（m/z 291 [M+H]⁺）、乙基化衍生物（m/z 319 [M+H]⁺）以及gigantol的二聚体产物（m/z 545–549 [M+H]⁺）。
值得注意的是，无论测试何种反应条件，两个主要产物（化合物4和5）始终出现，另有若干次要衍生物（化合物6至9）伴随生成。这些结果表明gigantol确实被漆酶成功转化，但底物从未被完全消耗——即使在最优条件下，仍有部分gigantol残留。
当研究人员缩短孵育时间并提高漆酶浓度时，反应路径发生了有趣的变化。一些不常见的衍生物（化合物12和13）开始出现，而部分次要产物的生成量则相应减少。这种条件依赖的产物分布变化，说明漆酶催化的转化途径具有高度可调性——通过改变反应参数，可以将代谢流导向不同的产物分支。
flavidin与coelonin的转化
对于菲类底物flavidin（化合物2）和coelonin（化合物3），研究同样进行了系统的条件优化。原文摘要未详述这两种底物各自的最优反应参数，但明确指出，根据反应条件的不同，转化过程可生成多种单体、二聚体和三聚体产物。这表明菲类骨架在漆酶作用下同样能够发生多层次的偶联反应，形成结构复杂度远高于底物本身的产物。
产物分离与结构鉴定
经过条件优化和放大反应后，研究人员对粗产物混合物进行了高效半制备液相色谱纯化。整个工作流程最终分离得到13个结构多样的衍生物，其中10个化合物为首次报道的全新结构。所有产物均通过高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）波谱进行了全面表征，确保结构归属的准确性。
从产物类型来看，这些衍生物涵盖了单体修饰产物（如羟基化、乙基化衍生物）以及通过自由基偶联形成的二聚体和三聚体。二聚体质荷比m/z 545–549的分布暗示可能存在多种异构形式，反映了漆酶催化偶联反应的位点选择性有限，但也正是这种"不精确性"带来了结构多样性。
反应条件与产物分布的关联
综合来看，漆酶浓度和反应时间对产物谱图的影响最为显著。高漆酶浓度和短孵育时间偏向生成特殊衍生物（化合物12和13），而低酶浓度和长时间孵育则有利于主要产物（化合物4和5）的积累。有机溶剂的比例同样关键——30%的有机溶剂浓度被证明是gigantol转化的最佳条件，过高或过低都会降低转化效率。
值得注意的是，gigantol在所有测试条件下均未被完全转化。这一现象可能与该底物在反应体系中的溶解性限制有关，也可能反映漆酶对二氢芪骨架的催化效率天然低于菲类底物。原文摘要未提供各产物的具体产率数据。
讨论与展望
这项研究展示了真菌漆酶在天然产物结构多样化中的实用价值。三种结构相关的底物在酶催化下生成了包括二聚体和三聚体在内的复杂产物，其中大部分是全新化合物。13个分离产物中10个为新结构，这一比例相当可观，说明漆酶催化的氧化偶联反应能够高效创造化学空间的新入口。
从方法学角度看，本研究的工作流程——分析规模条件筛选、放大反应、半制备HPLC纯化、HRMS与NMR结构鉴定——构成了一个完整的天然产物衍生化平台。干法上样技术的使用提高了纯化效率，而UHPLC-PDA-ELSD-MS的在线监测则确保了反应进程的精准把控。
研究中观察到的条件依赖产物分布值得深入思考。漆酶催化的反应本质上是自由基介导的，产物谱图受底物浓度、酶活力和溶剂环境的共同影响。高酶浓度下出现的特殊衍生物（12和13）可能源于反应速率加快后不同偶联路径的竞争。这种可调性为定向获取特定类型衍生物提供了操作空间。
本研究未涉及产物生物活性的测试，但考虑到底物gigantol、flavidin和coelonin本身即具有多种药理活性，其结构修饰产物——尤其是新化合物——有望成为生物活性筛选的候选分子。未来若能将这类酶促衍生化策略与高通量活性筛选相结合，或可加速新型先导化合物的发现进程。
参考来源
Favre-Godal Q, Marcourt L, Giraud M, Karmime Z, Marcellin-Gros R. Laccase-Catalyzed Biotransformation of Dihydrostilbenes and Phenanthrenes: A Route to Novel Natural Product Derivatives. ACS Omega. PMID: 42495288.
PMID: 42495288