来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷结构的高价值活性分子，但在栽培人参中天然不产生。本研究通过解析东北刺人参（Oplopanax elatus）染色体级基因组，发现其叶片大量积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，却因缺乏功能性C12羟化酶而无法完成下游氧化步骤。研究团队进一步在烟草中重构完整合成通路，实现了人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头生产，为三萜多样性演化提供了新见解，也为这类稀有皂苷的植物源生产开辟了可行路径。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是由C30骨架经糖基修饰形成的一大类特化代谢物，已报道结构超过两万种。它们在生态防御、根系微生物组塑造及人类药理活性（免疫调节、抗炎、抗癌相关）等方面发挥重要作用，因而成为代谢工程和合成生物学的重要靶标。人参属植物含有数百种结构各异的人参皂苷单体，主要基于达玛烷骨架并在C-3、C-6和/或C-20位发生不同糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2和Rk3）属于脱水人参皂苷家族，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，较母体化合物疏水性增强。这类皂苷在新鲜人参组织中几乎不存在，通常通过蒸制等热处理或酸处理过程获得。东北刺人参作为人参近缘种，其叶片积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架，但本身并不产生RK型人参皂苷，这为研究该类化合物的生物合成与进化提供了独特材料。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。该种群在室外遮阴区域栽培，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘以保持根系完整，迅速清洗后立即液氮冷冻，保存于−80 °C备用。各组织类型的形态见图1B。使用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。PacBio HiFi长读长测序共使用15 µg高分子量DNA，经gTUBE剪切后，利用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准SMRTbell文库，并通过BluePippin系统以15 kb为截断值进行大小选择以去除短片片段。HiFi一致性序列在PacBio Sequel II平台生成。按照标准Illumina文库构建流程后，Hi-C文库在MGIseq-2000测序平台进行定量和测序。
基因组从头组装与质量评估
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读段结合Hi-C数据进行组装。首先使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤获得高质量clean reads（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读段使用hifiasm v.0.16.1组装为单倍型分型contigs，并纳入Hi-C数据辅助组装过程。利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）进行contigs的染色体锚定、排序和定向。最终使用Juicebox v.1.11.08人工校正组装错误并进一步优化contig顺序和方向，获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子注释
采用从头预测和同源比对相结合的策略鉴定东北刺人参基因组中的重复序列。首先使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后使用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库注释已知重复元件。此外，使用TRF v.4.09.1鉴定和注释基因组内的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq的转录组预测。同源预测方面，使用TBLASTN v.2.2.31+（E值<1e-5）将近缘物种蛋白序列比对至组装基因组，使用Exonerate v.2.4.0的protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果和对应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组重复区域，利用同源预测的基因结构训练HMM模型，再使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，RNA-seq数据先用HISAT2 v.2.2.1比对至基因组，再用StringTie v.2.2.0组装转录本，使用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并优化转录本模型。最终使用MAKER2整合三种方法预测的基因模型生成高质量基因集。功能注释方面，使用BLASTP（E值<1e-10）将预测基因的蛋白序列比对至SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP结果分配功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析涉及东北刺人参及18个其他植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类基因家族。基于单拷贝基因家族提取phase 1或四倍简并（4D）位点，使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然（ML）系统发育树，1000次bootstrap重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。单拷贝直系同源基因的四倍简并位点进一步用于PAML v4.9j包中MCMCTree程序估算物种分化时间。分歧时间在贝叶斯框架下使用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree使用参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分歧时间。基因家族扩张和收缩使用CAFE v.4.2分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，使用PAML中codeml在F3X4模型下计算各共线性区块内基因对间的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E值<1e-5）鉴定，基于bit-score和E值排名选择最佳比对基因对，使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT），使用HMMER v.3.1b2在东北刺人参基因组中预测基因家族，E值阈值为<0.01。预测蛋白序列使用SeqKit v.2.6.1软件按长度进一步筛选：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。筛选后的基因家族成员使用在线工具Conserved Domain Database进行验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用已报道功能的植物基因序列与东北刺人参预测家族成员一起进行系统发育分析。所有分析所用序列见补充数据3–6。使用MAFFT v.7.518以默认参数进行多序列比对。使用FastTree v.2.2软件在默认设置下重建最大似然（ML）系统发育树。所得Newick格式树使用iTOL在线平台进行可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant总RNA提取试剂盒提取总RNA。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，此前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参三萜骨架的多样性和组织特异性分布，我们对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱裂解模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物在m/z 189的总离子流色谱图（TICs）和提取离子色谱图（EICs）中，在37.15分钟处出现一个显著未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征不同于α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇，难以通过质谱直接鉴定结构（图1D）。因此，我们从叶片中进行大规模提取、分离和纯化P1，并通过核磁共振波谱（NMR）确定其结构为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，我们使用市售人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3标准品进行靶向LC–MS分析。三种人参皂苷均未在叶片或任何其他检测组织中检出（图1E–G和补充图9）。综上，东北刺人参叶片积累RK前体骨架达玛二烯醇，但各组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，我们生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率高达8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读段和126.91 Gb（约71×）Hi-C读段用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964条contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定至24条假染色体的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定重复序列占组装的63.68%，预测61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史和东北刺人参的系统发育位置，我们分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建最大似然树，将五加科分为两个高支持率分支：一支包含刺五加和东北刺人参，另一支包含辽东楤木及5个人参属物种。该拓扑结构表明东北刺人与刺五加的亲缘关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B分别形成两个独立分支，与东北刺人参的亚基因组A和B分别聚类，表明两者共享涉及两个分化祖先谱系的异源多倍化起源。异源四倍体人参属物种也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能源自一个类似二倍体五加科植物的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群组的MCMCTREE分歧时间估算（使用TimeTree化石校准），五加科与伞形科的分化时间约为68.2百万年前，五加科两个主要谱系的分离约为28.5百万年前。重要的是，东北刺人参的亚基因组A和B分化于约23.2百万年前，早于辽东楤木-人参属分支内的物种分化时间（图2B）。进一步比较候选植物基因组，获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜与三萜生物合成（KEGG）中过度代表，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。我们因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。分析揭示两个显著峰，分别位于约0.3和约0.1处（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。该推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与葡萄之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种在约0.1处出现二倍体物种中不存在的额外Ks峰。每个异源四倍体两个亚基因组间的直系同源基因对也在约0.1处显示一个峰。与此模式一致，共线性分析揭示葡萄、辽东楤木、人参和东北刺人参之间存在1:2:4:4关系，支持五加科在共享WGD之后发生了较近期的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中积累，我们假设东北刺人参基因组编码一种特异性催化2,3-氧化鲨烯环化形成达玛二烯醇的氧化鲨烯环化酶（OSC）。为验证该假设，使用已知人参OSC序列对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定的OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
讨论与解读
本研究通过整合染色体水平基因组组装、比较基因组学和生化分析，揭示了东北刺人参中OeOSC14作为特化达玛二烯醇合酶的进化机制——该酶由祖先多功能三萜合酶经复制和新功能化而来。单氨基酸替换N260Y即可将OeOSC14从达玛二烯醇特异性酶逆转回多功能三萜合酶，这一发现精准定位了功能转换的关键位点。研究还证实，C12羟化酶功能的缺失阻断了东北刺人参中RK型人参皂苷生物合成所需的下游氧化步骤。在烟草中重构完整通路实现了人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的从头生产，为三萜多样化提供了进化见解，也建立了这些化合物的植物基生产路线。
编译者解读
该研究巧妙利用了"近缘物种积累前体但不产终产物"这一天然实验，通过比较基因组学锁定关键酶的功能分化，展示了进化视角在合成生物学中的独特价值。N260Y单点突变的功能逆转实验为酶工程提供了精准靶点。在烟草中重构三步异源合成路径实现RK型人参皂苷生产，验证了植物底盘合成稀有天然产物的可行性。局限在于目前产量仍较低，后续可通过酶工程优化、通路区室化或底盘改造进一步提升。该策略对其它"前体积累但通路中断"的药用植物具有普适借鉴意义。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661