来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现应用价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但因所需基因数量多及不同颜色光之间的交叉激活问题，多种波长的光遗传学一直未能在酵母中实现多路复用。本研究开发了仅需单基因、无需外源辅因子的红光响应光遗传系统y-iLight，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，与EL222蓝光系统整合，建立了酿酒酵母双通道光遗传平台，实现了黄酮木犀草素合成的光控及细胞絮凝辅助产物提取，并展示了多色活体材料图案化潜力。
研究背景
光遗传学是合成生物学新兴领域，利用光控制细胞过程。相比传统化学调控方法，光遗传学优势包括避免有害化学品、与生物系统正交、可通过引入和移除光实现动态控制以及具备空间分辨率。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光等多种波长光遗传系统的发展，一个独特优势是可将不同颜色光多路复用，实现细胞内不同功能的独立正交控制，将不同功能置于不同光"通道"的动态控制之下。
虽然多路光遗传学已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑正交的光遗传系统及不同颜色光之间的交叉激活问题，酿酒酵母仅应用了单波长单通道光遗传学来开关特定通路。酿酒酵母是强大的模式生物，遗传学和生物学背景清晰，已广泛用于合成生物学应用，如生产有价值的化学品、药物、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品和临床治疗等。
研究方法
双通道光遗传学在生物材料图案化中的应用
本研究中双通道光遗传学的最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光图案在特定位置指定细胞中基因激活的能力，对生物材料、神经科学和微生物群落相互作用研究具有重要价值。展示光遗传学空间特性的一种常用方法是将图像投影到携带光敏感启动子控制下彩色或荧光基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"印刷"到细胞上。虽然多色图像已在大肠杆菌中实现，但酿酒酵母仅通过单通道光遗传学实现了单色图像。
为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了菌株OY-γ.RB（红-蓝）。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝），在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。
OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投影到表面（补充图16）。图案被切割成黑色纸张，作为滤光片，用红光照射选定区域24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，不需要NIR光来消除交叉激活（补充图17）。使用这种方法，成功印刻了从字母到标志和精细图像的多种多色图案，展示了系统的高空间分辨率和开发复杂活体材料的潜力。
研究结果
在酿酒酵母中开发单组分红光通道
多种红光响应转录因子已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发。然而，其缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子，或需要额外基因用于体内辅因子的内源合成。预期双通道系统中包含过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，我们寻找了一种功能性单组分红光敏感转录因子，可利用内源辅因子。据我们所知，虽然尚未在酿酒酵母中实现此类系统，但iLight系统已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分远红光转录因子，通过工程改造光敏感的IsPadC BphP蛋白获得。该蛋白由DNA结合域与IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合组成，PCM形成同源二聚体阻止DNA结合域的二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变允许DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它依赖内源产生的胆绿素IXa。因此，我们推断它在酿酒酵母中同样能发挥作用，因为酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。
细菌中展示的iLight版本不能直接适应酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不理想，因为它利用酿酒酵母Gal4 DNA结合域，与酿酒酵母生物学不正交。为工程改造适合酿酒酵母的系统，我们将iLight哺乳动物变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白。LexA常用于正交合成酿酒酵母转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA域，我们推断该蛋白构象与野生型LexA相似地功能。由于原始SV40 NLS已融合到Gal4域的N端，SV40 NLS被重新附加到C端，产生命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由CYC1核心启动子（cPCYC1）上游的8个串联lexO重复序列阵列组成。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，克隆了两个额外质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆在低拷贝附加体质粒上的mCitrine荧光报告基因上游，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。
所有3个转化体在光遗传学光箱（Optobox）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养。ACT1启动子（PACT1）在工业和研究应用中常用作酿酒酵母特征明确的启动子。为衡量工程启动子能否驱动足够水平的基因表达以用于实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，用组成型PACT1替换y-iLight启动子并连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与黑暗条件相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功重构为在酿酒酵母中工作，无需任何额外辅因子。
不同核心启动子导致不同水平的报告基因表达，值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600未显示任何生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的伪影。红光启动子非线性行为的一个可能解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为核心启动子附近转录激活子的结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是"促进扩散"，即由于转录因子在DNA链上拥挤，虽然初始结合速率增加，但转录因子停留时间减少，导致启动子表达不佳。两种提出的机制都表现为高浓度活性转录因子存在下启动子表达降低。
三种启动子可能对光有不同的敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点以及DNA区域，而该区域是……
讨论与解读
开发酿酒酵母单组分红光光遗传系统
我们将响应红光刺激的光遗传系统重构为适用于酿酒酵母，仅需单个转录因子且不依赖任何外源添加的辅因子。这解决了酿酒酵母缺乏紧凑型单组分红光光遗传系统的问题，使光遗传学在酿酒酵母中的多路复用应用成为可能。相比之下，最近为酿酒酵母开发的红光响应转录因子PhiReX需要表达四个不同基因，包括用于合成酿酒酵母非内源辅因子的基因。使用PhiReX 1.1可实现高达41倍诱导，水平与酿酒酵母天然启动子PADH1相似；PhiReX 1.0可实现约PADH1强度的2倍，但仅11倍诱导。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然酿酒酵母启动子PACT1相当。因此，y-iLight系统的动态范围介于PhiRex 1.0和1.1之间，同时与常用天然启动子水平相当。
一个意外发现是蓝光与红光通道之间存在交叉激活，阻碍了双通道光遗传学的活性。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在其基态吸收可见光谱红光范围……
编译者解读
本研究通过单基因红光系统与EL222蓝光系统的整合，巧妙规避了多基因整合带来的代谢负担，为酵母光遗传多路复用提供了紧凑方案。模块化蛋白工程降低蓝光交叉激活的策略具有通用借鉴意义。双通道系统驱动木犀草素合成与絮凝提取的闭环演示，展示了光控代谢流分配在天然产物生产中的实用价值。未来若能将光穿透深度限制与工业化光生物反应器结合，该平台有望在精细化学品生物制造中落地应用。
PMID: 42173879