来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
乳酸菌的遗传改造长期受困于其厚实的肽聚糖细胞壁、低转化效率及菌株特异的限制修饰系统。德国研究人员以植物乳杆菌8P-A3为对象，通过系统优化CRISPR/Cas9编辑条件，成功敲除细菌素合成通路中的负调控基因plnD，使菌株抗菌活性显著提升。这项发表于《Journal of Biological Engineering》的工作，为食品级乳酸菌的理性改造提供了可复用的技术路径。
研究背景
乳酸菌作为公认安全（GRAS）的微生物，在食品发酵、益生菌制剂和抗菌肽生产中扮演核心角色。其中，植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）合成的Ⅱ类细菌素——植物乳杆菌素（plantaricin），对食源性致病菌具有广谱抑制活性，被视为天然防腐剂的理想来源。然而，细菌素的合成受群体感应（quorum-sensing）网络精密调控，产量往往受限于调控节点的负反馈机制。
植物乳杆菌8P-A3菌株分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum，其基因组中含有完整的plantaricin基因簇。在该调控网络中，plnD基因编码的组氨酸激酶是感知群体密度信号的关键元件，对细菌素合成起负调控作用。理论上，敲除plnD可解除抑制、激活下游结构基因的高效表达，但实际操作面临多重技术壁垒：乳酸菌厚实的细胞壁阻碍外源DNA摄入，菌株特异的限制修饰系统会降解外源甲基化模式不符的质粒，而Cas9蛋白引发的双链断裂对许多乳酸菌具有致死效应。
研究者选择双质粒SpCas9系统作为编辑工具，试图通过精细优化转化条件和编辑流程，在8P-A3菌株中实现plnD的靶向敲除。这一策略的难点在于平衡编辑效率与细胞存活率——Cas9活性过强会导致菌株死亡，活性不足则无法完成编辑。
研究方法
菌株与培养条件
研究使用的植物乳杆菌8P-A3菌株由俄罗斯实验医学研究所Alexander Suvorov博士惠赠，最初分离自商业益生菌制剂Lactobacterinum siccum（Microgen，莫斯科）。菌株在MRS培养基（pH 5.7，Carl Roth GmbH，货号HP64.1）中培养。常规培养条件为：MRS培养基添加适量抗生素，37°C、150 rpm振荡培养12–16小时，厌氧环境通过BD GasPak™ EZ产气袋系统（货号260683，BD Company）配合指示剂实现。固体培养基使用MRS琼脂（Carl Roth GmbH，货号HP65.1）。
电转感受态细胞制备
电转感受态制备涉及两种关键溶液。MRS-G溶液（2.5%甘氨酸-MRS）：称取0.625 g甘氨酸溶于25 mL MRS肉汤，经0.22 μm滤膜过滤除菌。SacGly溶液：将85.55 g蔗糖溶于400 mL水中，再加入100 mL 50%甘油。改良MRS培养基（MMRS）用于电击后细胞复苏，配方为MRS肉汤中添加500 mM蔗糖、20 mM MgCl₂和2 mM CaCl₂。
电转化操作使用Bio-Rad MicroPulser电穿孔仪（货号1652100）及0.1 cm间隙的Gene Pulser/MicroPulser电转杯（货号1652093）。
双质粒CRISPR/Cas9系统构建
编辑系统采用双质粒设计。CR质粒（pCB578）携带SpCas9基因、tracrRNA以及repeat–spacer–repeat结构单元，负责表达Cas9蛋白和引导RNA。RT质粒（pCB591）携带供体修复模板——包含目标位点的内部缺失/突变序列，用于引导同源定向修复（HDR）。两个质粒的组装完整性通过菌落PCR（cPCR）、限制性酶切和Sanger测序三重验证。
编辑流程
验证正确的质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3菌株，获得携带双质粒的CRM（CRISPR-modified）菌株。电转化后的细胞在MMRS培养基中复苏。编辑完成后，菌株在无抗生素培养基中连续传代，以筛选丢失红霉素和氯霉素抗性的菌落——抗性丢失意味着两个质粒均已被成功清除。
编辑验证
plnD敲除的验证采用多重策略。首先，使用侧翼引物对plnA–plnD全基因座进行PCR扩增，比较CRM菌株与野生型（WT）菌株的扩增产物大小差异。其次，对编辑区域进行靶向扩增子测序，测序数据分别用Geneious Prime、Benchling、SnapGene等多平台独立进行高严谨度比对分析，确认HDR介导的删除连接位点及突变碱基。
基因表达与抗菌活性检测
编辑菌株中plnA、plnE、plnF等细菌素结构基因的表达水平通过实时定量PCR检测。抗菌活性采用琼脂扩散法或微量稀释法测定，以抑菌圈直径或最小抑菌浓度（MIC）量化抑菌效果。
原文摘要未详述电转化具体参数（电压、电阻、脉冲时间）及qPCR内参基因、抗菌活性检测的具体指示菌株。
研究结果
编辑系统构建与验证
双质粒系统成功构建。CR质粒pCB578和RT质粒pCB591经菌落PCR、限制性酶切及Sanger测序验证，组装完全正确。两个质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3后，成功获得携带完整编辑系统的CRM菌株。
plnD基因敲除确认
在无抗生素培养基中连续传代后，成功筛选到同时丢失红霉素和氯霉素抗性的菌落，表明两个质粒均已被清除。这一结果证实编辑过程已完成，且质粒不再对菌株产生选择压力。
PCR扩增plnA–plnD全基因座的结果显示，CRM菌株的扩增产物明显短于野生型菌株，片段大小差异与plnD基因内部缺失的预期一致。靶向扩增子测序进一步提供了核苷酸水平的确认：Geneious Prime、Benchling、SnapGene三个独立平台的高严谨度比对均显示一致的HDR介导删除连接位点，且在plnD基因区域内存在若干突变碱基。
关键的是，CRM等位基因完全缺失了20 nt的间隔序列识别位点及其相邻的5′-NGG PAM基序。这意味着即使残留的Cas9蛋白再次表达，也无法识别该位点——编辑事件是不可逆的，且不会发生重复切割导致的细胞毒性。
基因表达变化
plnD敲除后，群体感应调控网络的下游靶基因被显著激活。定量PCR检测显示，细菌素结构基因plnA、plnE和plnF的表达水平均出现上调。这三个基因分别编码植物乳杆菌素的前体肽和加工/转运相关蛋白，其同步上调表明整个细菌素合成通路已被解锁。
抗菌活性增强
与基因表达上调相一致，CRM菌株表现出升高的抗菌活性。抑菌实验结果显示，编辑菌株对指示菌的抑制效果强于野生型菌株。原文摘要未提供抑菌圈直径的具体数值或最小抑菌浓度的定量数据，但明确指出抗菌活性的提升与plnA、plnE、plnF的上调表达相关联。
讨论与展望
这项研究的价值在于解决了乳酸菌基因编辑的"最后一公里"问题。双质粒系统本身并非全新设计，真正的难点在于将编辑效率与细胞存活率之间的平衡调到最佳——plnD敲除后PAM基序的完全缺失，恰好规避了Cas9持续切割导致的菌株死亡风险，这一设计细节值得借鉴。
从应用角度看，plnD作为群体感应网络的负调控节点，其敲除相当于解除了细菌素合成的"刹车"。这种通过重构调控回路而非直接过表达结构基因的策略，更符合代谢工程的系统思维。植物乳杆菌8P-A3本身来源于商业益生菌制剂，其食品安全背景清晰，改造后的菌株在食品防腐、饲料添加剂等场景中具有明确的转化潜力。
当然，研究仍留有开放问题。编辑效率的具体数值、抗菌活性的定量数据（抑菌圈直径、MIC值）在摘要中未详述；编辑菌株在发酵条件下的生长动力学、遗传稳定性以及细菌素产量是否达到工业化水平，均有待后续研究补充。此外，该平台能否推广至其他乳酸菌菌株，取决于菌株特异的限制修饰系统是否兼容，这需要更多菌株层面的验证。
参考来源
Anand R, Lütticken R, De Laporte L, Herrmann A, Heine E. An optimized CRISPR/Cas9-based genome editing platform enhances bacteriocin production in Lactiplantibacillus plantarum. Journal of Biological Engineering. PMID: 42527938.
PMID: 42527938