黄曲霉毒素与杂色曲霉素在坚果中的定量分析及产毒差异

来源：Mycotoxin Res | 编译：DNA Lab Space

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导读

坚果营养丰富，却易被产毒真菌定殖。本研究以五种市售坚果为基质，接种五株不同产毒潜力的黄曲霉，通过UHPLC-MS/MS结合稳定同位素稀释分析，系统比较了黄曲霉毒素B1、B2及杂色曲霉素在不同坚果中的生成差异。结果令人警醒：核桃对黄曲霉毒素合成表现出远超其他坚果的"易感性"，毒素浓度最高超过11,000 µg/kg，而开心果在相同条件下几乎不产毒。

研究背景

坚果富含蛋白质、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，是全球饮食中营养密度最高的食物类别之一。虽然从植物学角度，腰果、开心果和花生并非真正的坚果，但日常语言中统称"坚果"，本文亦沿用此统称涵盖所有研究基质。德国市场数据反映了坚果消费的快速增长：坚果种植面积从2018年的600公顷增至2024年的1,600公顷，2024/25年度坚果及干果消费量达48.2万吨，2024年市场规模约30.4亿欧元，预计2030年将接近39亿欧元。

树坚果易被多种真菌定殖，导致腐败并产生有毒次生代谢物。产毒黄曲霉是其中的重点关注对象——其产生的黄曲霉毒素具有肝毒性。本研究选取五种市售坚果，在控制条件下接种不同黄曲霉菌株，系统比较毒素生成差异。

研究方法

化学试剂与材料

LC-MS级乙腈和甲醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）；LC-MS级超纯水由Th. Geyer提供（德国雷宁根）。氯化钠购自Avantor（原VWR，德国达姆施塔特）；无水硫酸镁、甲酸、氨水溶液和甲酸铵溶液购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆），纯度均为分析级或更高。分散固相萃取（dSPE）净化管使用Supel™ QuE PSA（伯胺/十八烷基硅烷）管，含400 mg Discovery™ DSC-18、1200 mg无水MgSO₄和400 mg Supelclean™ PSA，购自Sigma-Aldrich。Oxoid™林格氏液片剂购自Thermo Fisher Scientific（德国达姆施塔特）；Tween® 80购自Sigma-Aldrich Canada Co（加拿大安大略）；麦芽提取琼脂购自Millipore（加拿大安大略）；乙醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）。

样品

去壳但未经其他处理的核桃、腰果、榛子、花生和开心果样品购自德国市场，室温避光保存至后续处理。

分析标准品

混合黄曲霉毒素乙腈溶液（AFG1、AFG2、AFB1、AFB2各1 µg/mL）及未标记杂色曲霉素购自Romer Labs（原Biopure，奥地利图尔恩）。稳定同位素标记标准品[¹³C₁₇]AFG1、[¹³C₁₇]AFG2、[¹³C₁₇]AFB1、[¹³C₁₇]AFB2和[¹³C₁₈]STC由Fianovis提供（原Libios，法国温德里苏蒂尔丹）。

储备液配制

购买的标记及未标记毒素储备液用乙腈进一步稀释，得到0.1、0.01和0.001 µg/mL的工作浓度。所有溶液于-28 °C保存。

黄曲霉菌株

为涵盖菌株间差异，基于实验室可获得性选取五株产毒潜力不同或未表征的黄曲霉菌株：DSM 1959、NRRL 3357、AF 70、CBS 119.62和NRRL 1957。所有菌株在慕尼黑工业大学微生物学教研室麦芽提取琼脂上培养。

黄曲霉接种

孢子悬浮液制备：黄曲霉菌株在麦芽提取琼脂上培养以获得孢子，用灭菌林格-Tween溶液（25%（w/v）林格氏液水溶液，0.1% Tween（v/v））收获孢子。孢子悬浮液浓度通过将系列稀释液涂布于麦芽提取琼脂并计数菌落确定。随后用林格-Tween溶液将孢子悬浮液调整至约1×10⁵孢子/mL，并通过重新涂布和菌落计数验证。孢子悬浮液制备方法改编自弗劳恩霍夫过程工程与包装研究所（IVV）的方案。

表面消毒：参照Amini等（2016）的方法，使用95%乙醇进行表面消毒。坚果仁浸泡于乙醇/水溶液（95:5，v/v）中，在层流罩（BDK，德国索嫩比尔-根金根）内室温过夜干燥。之后将坚果放入带DURAN®含膜盖（孔径=0.2 μm）的无菌实验室烧瓶中。表面消毒效果通过预实验评估：取10 g核桃，用5 mL林格-Tween溶液洗脱表面微生物，随后涂布于麦芽提取琼脂。预实验确认了95%乙醇对核桃仁表面消毒的有效性。选择该表面消毒方法是为了尽量减少对样品材料的改变——这种改变可能影响真菌生长和黄曲霉毒素生成潜力，尤其希望避免高压灭菌等热处理带来的变化。

接种：接种设两个生物学重复。核桃样品接种所有五株黄曲霉菌株，而腰果、榛子、花生和开心果样品仅接种AF 70和CBS 119.62菌株。对照样品用无菌林格-Tween溶液代替孢子悬浮液处理。接种条件参照Assunção等（2015）的规程：30 °C、95%相对湿度下培养20天，设两个生物学重复。100 g表面消毒后的坚果仁与相当于果仁质量2%（w/w）的孢子悬浮液混合，然后在气候箱（Climacell EVO，MMM Group，德国慕尼黑）中按指定条件培养。

孢子灭活：基于黄曲霉孢子的热敏感性（Zhang等，2018），接种实验结束后样品立即在55 °C干燥90 min，以实现完全孢子灭活。

研磨：每个样品随后用实验室粉碎机（Grindomix GM 200，Retsch GmbH，德国哈恩）研磨，于-28 °C保存至进一步样品制备。

水分含量：使用红外干燥水分分析仪（Kern & SOHN GmbH，德国巴林根-弗罗默恩）测定样品水分含量。取2.5 g均质化样品，在120 °C下干燥至恒重，根据记录的质量损失计算水分含量。

真菌毒素提取：所有样品（未处理坚果、表面消毒坚果、对照和接种坚果）的样品制备均按照Schneidemann-Bostelmann等（2026）的规程进行，每个样品设三个重复。所有细节汇总于补充信息（补充表1）。

方法验证：所用方法已根据Vogelgesang和Hädrich（1998）的规程完成验证（Schneidemann-Bostelmann等，2026），验证结果汇总于补充信息（补充表2）。

校准与定量：所有分析物通过稳定同位素稀释分析（SIDA）定量。校准曲线通过将固定量的稳定同位素标记内标（IS）与不同浓度的相应未标记分析物（A）混合制备，得到n(A)/n(IS)摩尔比在0.01至100之间（1:100、1:50、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1）。将色谱峰面积比[A(A)/A(IS)]对相应摩尔比[n(A)/n(IS)]作图构建校准函数。采用线性回归获得响应曲线，线性通过Mandel拟合检验验证（Mandel，1964）。

UHPLC-MS/MS分析：UHPLC-MS/MS测量以Dick等（2024）和Schneidemann-Bostelmann等（2026）先前描述的方法为基础。但本研究中将除AFs和STC外的所有分析物从方法中移除，因为它们与本研无关。色谱分离使用Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统（Shimadzu，日本京都）。色谱柱为Waters BEH C18 UHPLC柱（Acquity BEH C18，100 mm，1.7 μm × 2.1 mm；Waters GmbH，德国埃施博恩），柱温40 °C。流动相流速设为0.3 mL/min。二元梯度由溶剂A（5 mM甲酸铵水溶液，用25% NH₄OH溶液调至pH 9）和溶剂B（甲醇）组成。梯度程序：起始5% B保持2 min，1 min内升至18% B；随后2 min内逐步升至25%；之后8 min内升至90%，0.5 min内进一步升至99%，保持2 min；随后3.5 min内回到5% B，再平衡5 min。进样体积——

（注：原文此处截断，后续进样体积参数原文未详述。）

研究结果

不同坚果类型中检测到的真菌毒素水平综合数据（包括AFB1、AFB2和STC）见图5和图6。精确浓度列于补充信息（补充表4–7）。对照及接种AF70和CBS 119.62菌株的坚果图像见补充信息（补充图1–22）。

不同菌株接种后核桃中黄曲霉和杂色曲霉素的产生

对接种不同黄曲霉菌株的核桃中AFs和STC的定量分析显示，AFB1、AFB2和STC的产生具有强烈的菌株依赖性，而所有样品中均未检测到AFG1和AFG2。这一观察与黄曲霉已知的生物合成能力高度一致——黄曲霉产生B型黄曲霉毒素和杂色曲霉素，但不产生G型黄曲霉毒素（Ráduly等，2020）。因此可以认为接种成功，且未发生与其他曲霉属物种的交叉污染。未处理的核桃未检测到AFs或STC，表面消毒样品同样未检出。两个对照样品中有一个检出了低水平AFB1（0.18 ± 0.09 µg/kg），该样品出现可见真菌污染。虽然菌丝体的表型外观类似曲霉属，但未进行分类学确认。然而，鉴于核桃产自德国——在生态学上天然被产毒黄曲霉或寄生曲霉污染的可能性极低——且消毒规程已在预实验中验证，该单次事件最可能代表实验室二次污染，而非原料的基线定殖。

逐一考察各黄曲霉菌株时，几乎所有的菌株都能产生AFB1。此处报告的AFB1浓度增加特指初始未接种基质的基线水平与培养后检测水平之间的差异。在α = 0.05显著性水平下，接种AF70菌株的样品（1494 ± 180 µg/kg和超过11,000 µg/kg）、接种CBS119.62菌株的样品（0.30 ± 0.02 µg/kg和23.4 ± 4.95 µg/kg）、接种NRRL 1957菌株的样品（0.18 ± 0.09 µg/kg和0.95 ± 0.02 µg/kg）以及接种NRRL 3357菌株的样品（569 ± 82.6 µg/kg和151 ± 1.31 µg/kg）中AFB1浓度均显著增加。只有DSM 1959菌株无法在核桃上产生AFB1。AFB2和STC仅在AF70（AFB2：147 ± 13.6 µg/kg和1,411 ± 298 µg/kg；STC：60.2 ± 2.17 µg/kg和262 ± 36.1 µg/kg）、NRRL 3357（AFB2：76.8 ± 3.92 µg/kg和9.51 ± 0.86 µg/kg；STC：4.00 ± 0.06 µg/kg和1.29 ± 0.20 µg/kg）以及CBS 119.62的一个生物学重复（AFB2：3.58 ± 0.38 µg/kg；STC：0.26 ± 0.04 µg/kg）中达到显著水平。然而，由于NRRL 3357菌株的菌丝生长明显强于AF70和CBS 119.62，我们决定使用AF70和CBS 119.62接种其他坚果品种。这一选择主要是出于安全考虑——尽量减少后续样品均质化过程中的粉尘形成和潜在孢子气溶胶化，从而降低生物安全风险。生物学重复之间观察到的差异可能由潜在的热点效应解释：如果重复中的单个坚果含有比其他坚果更高的毒素浓度，接种后均质化可能导致样品总AF水平升高。

AF70和CBS 119.62菌株接种后核桃、榛子、腰果、开心果和花生中黄曲霉和杂色曲霉素的产生

与核桃中观察到的结果一致，腰果、开心果、榛子和花生中仅检测到B型AFs和STC，未检测到G型AFs，表明黄曲霉接种成功且无交叉污染。未处理的榛子和腰果不含AFB1、AFB2和STC，而开心果原料含有AFB1（0.76 ± 0.11 µg/kg）、AFB2（0.35 ± 0.06 µg/kg）和STC（0.22 ± 0.01 µg/kg）。花生原料被STC污染（0.25 ± 0.01 µg/kg）。

考察用于接种不同坚果基质的两个菌株时，AF70菌株能在除开心果外的所有坚果上产生AFB1，且与各自起始材料相比，AFB1浓度在α = 0.05显著性水平下显著增加（腰果：0.11 ± 0.01 µg/kg和0.16 ± 0.02 µg/kg；榛子：0.11 ± 0.01 µg/kg和3.56 ± 0.90 µg/kg；花生：0.16 ± 0.05 µg/kg和17.9 ± 8.27 µg/kg）。接种AF70菌株导致腰果中AFB2浓度升高（两个样品均在LOD和LOQ之间）、花生中升高（5.43 ± 0.94 µg/kg和6.54 ± 1.19 µg/kg），以及接种榛子的一个生物学重复中升高（0.18 ± 0.02 µg/kg）；而STC形成仅在花生的一个生物学重复（5.28 ± 0.18 µg/kg）和榛子的一个生物学重复（0.08 ± 0.02 µg/kg）中观察到。在开心果上，该黄曲霉菌株未产生任何AFs或STC。与核桃上的毒素形成相比，该菌株在核桃上产生的AFB1、AFB2和STC浓度明显高于其他受检坚果。

CBS119.62菌株仅在花生的一个生物学重复中产生AFB1（0.06 ± 0.01 µg/kg），在花生中产生AFB2（7.59 ± 1.13 µg/kg和0.26 ± 0.04 µg/kg），并在榛子的一个生物学重复中产生AFB2（0.13 ± 0.03 µg/kg）。与在核桃上的行为相反，该菌株在其余受检坚果上均未产生STC。黄曲霉菌株CBS 119.62无法在开心果上产生AFs或STC。如核桃部分所述，其他坚果也应考虑热点效应的可能性——单个受污染果仁即可导致个别样品中AF水平升高。

不同坚果基质上AF和STC形成的比较及文献数据

比较不同坚果基质上的AF形成可见，受检黄曲霉菌株在核桃上产生的B型AFs和STC浓度显著高于其他坚果。这与Molyneux等（2007）的发现形成对比——他们报道了核桃中没食子酸和其他抗氧化化合物具有抑制AF的特性。但他们也指出，这些化合物必须存在于种皮（内皮）中而非胚乳中，因为不含种皮的果仁材料未表现出抑制活性——

（注：原文此处截断。）

讨论与解读

不同坚果基质接种黄曲霉后AFB1、AFB2和STC的定量分析揭示了这些曲霉毒素形成的显著菌株依赖性。受检菌株产生AFs和STC的能力差异显著，但核桃始终支持比其他四种坚果明显更高的AF形成。这些发现将核桃确定为在本研究实验条件下黄曲霉毒素合成特别有利的基质。这种增强的易感性背后的机制尚不清楚，可能与核桃特有的基质特性有关——如核桃独特的脂肪酸组成、营养可利用性，或种皮完整性及其相关抗菌化合物。观察到的基质特异性差异表明，坚果类型能强烈影响黄曲霉的产毒潜力。

虽然核桃目前受AF污染的频率低于开心果或花生，但文献数据显示，某些情况下核桃中可出现非常高的AF水平——如摩洛哥核桃中报道的浓度高达2,500 µg/kg（Juan等，2008）。这支持了本研究结果，表明尽管核桃中AF目前尚不令人担忧，但在未来气候变化的背景下，核桃积累高浓度AF的潜力可能成为欧洲未来的健康关切。

编译者解读

本研究最大的价值在于用统一的实验框架揭示了"基质-菌株"双因素对黄曲霉毒素积累的决定性影响——核桃上超过11,000 µg/kg的AFB1产量与开心果上"零检出"形成鲜明对比，这种数量级差异为坚果供应链的风险分级提供了直接依据。从合成生物学视角看，黄曲霉在不同坚果上的产毒差异本身就是一座天然的"代谢调控金矿"：核桃基质中究竟是何种成分激活了黄曲霉的聚酮合酶通路，值得深挖。局限在于，研究仅覆盖五种坚果和五株菌，且未对核桃"高易感性"的分子机制进行解析——这恰恰是后续工作最值得突破的方向。

PMID: 42550348