来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
甾体类药物是全球销售额仅次于抗生素的第二大类药物，传统依赖植物皂素提取或化学半合成的生产方式正面临资源、环境与效率的多重挑战。合成生物学的崛起为这一领域带来了变革性机遇。Jimoh 等人在 2025 年发表的综述中，系统梳理了以酿酒酵母为底盘、通过代谢工程强化甾体生物合成的最新进展与核心策略，深刻揭示了从途径重构到工业放大的关键路径，为绿色、可持续的甾体制药提供了全新蓝图。
一、研究背景
甾体化合物是一类以环戊烷多氢菲为母核的萜类天然产物，广泛作为抗炎药、避孕药、激素替代治疗药物等活跃于临床。全球每年甾体原料需求量超过千吨，传统工艺依赖薯蓣皂素、剑麻皂素等植物提取，不仅受产地与季节限制，且提取与化学改造步骤冗长，伴有大量有机溶剂和重金属催化剂使用。随着甾体药物市场持续扩容，开发微生物细胞工厂、实现从简单碳源到复杂甾体分子的直接合成，成为绿色制药的前沿方向。
酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）被公认为真核模式底盘，具有清晰的遗传背景、成熟的基因操作工具和较强的内源甲羟戊酸（MVA）途径，为萜类前体的供给提供了天然优势。更重要的是，酵母含有内质网膜系统和氧化还原调控网络，能有效支持植物或哺乳动物来源的细胞色素 P450 单加氧酶等功能蛋白的表达与活性，这对甾体分子中多个位点的区域及立体选择性氧化至关重要。然而，野生酵母并不具备完整的甾体合成途径，此前研究多集中于单步生物转化，距离从头合成高产还有很远距离。Jimoh 等撰写的综述正是在这样的大背景下，全面评估了代谢工程手段如何将酿酒酵母打造为高效甾体合成的细胞工厂，并总结了从基础研究到工业落地的关键策略。
二、研究方法（综述视角下的技术路线）
该综述并非一项独立实验研究，而是对已有文献的系统综合与批判性分析。作者梳理了近二十年来在酿酒酵母中开展甾体生物合成代谢工程的工作，将其技术路线归纳为四个层次：**途径构建与异源表达优化、前体与辅因子供应强化、细胞生理与耐受性重塑、以及过程工程与放大适配**。
1. 异源途径的模块化重构
甾体骨架的合成首先需要将乙酰辅酶 A 经由 MVA 途径转化为法尼基焦磷酸（FPP），继而在鲨烯合酶、鲨烯环氧酶等作用下生成 2,3-氧化鲨烯，再经一系列氧化鲨烯环化酶环化产生植物甾醇或胆固醇前体。综述重点分析了不同来源（哺乳动物、植物、真菌）关键酶在酵母中的适配性改造，尤其是**密码子优化、N-端跨膜区工程、融合标签和定位信号**等手段如何提高 P450 及还原酶伴侣（CPR）的电子传递效率。例如，将哺乳动物 CYP11A1 与植物来源的电子传递链组合，可成功在酵母中实现胆固醇侧链裂解，生成孕烯醇酮——甾体激素合成的共同前体。
2. 前体与辅因子的动态调控
MVA 途径的碳通量受限于羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的反馈抑制，综述列举了**截短型 HMGR（tHMGR）过表达、竞争支路（如角鲨烯下游）的弱化、以及转录因子全局扰动**等策略。为促进 P450 催化的氧化反应，**NADPH 再生系统**的强化也是重点，如过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）或引入非天然辅因子循环。此外，通过对甾醇酰基转移酶（ARE1/2）的敲除，可消除中间产物的酯化储存，使碳流更集中地进入目标甾体路径。
3. 细胞工厂的抗逆与定向进化
甾体中间体及终产物常具有膜毒性，综述介绍了利用**适应性实验室进化（ALE）和转录组学指导的靶点挖掘**来增强酵母耐受性。例如，通过连续传代提升菌株对高浓度孕烯醇酮的耐受，并发现麦角甾醇合成相关基因的差异表达。同时，多位点自动化基因组进化（MAGE）及基于 CRISPR/Cas9 的多元调控，实现了途径酶表达强度的精确配比。
4. 发酵工艺与工业衔接
为贴近工业应用，综述还评价了**分批补料发酵、双相萃取发酵**以及**原位产物移除**（ISPR）等技术对甾体产量的提升效果。由于大部分甾体分子疏水性强，直接在发酵液中添加油醇或大孔树脂吸附产物，能显著降低产物反馈抑制并简化后续纯化。
三、研究结果（核心数据与关键发现）
综述整合了截至 2025 年的多项里程碑式成果，呈现出酿酒酵母在甾体合成领域的巨大跃升。
**产量突破与途径拓宽**
早期工作仅能实现毫克每升级的甾体中间体（如孕烯醇酮）生产，而通过模块化途径工程与中心代谢重编程，**氢化可的松、黄体酮、睾酮等重要激素的摇瓶产量已提升至克每升级水平**。其中一项代表性工作中，经多达 15 个异源基因的协同表达与 6 个酵母内源基因的修饰，实现了从简单糖到黄体酮的完整合成，产量达 2.3 g/L 以上。对于更为复杂的 C19 和 C18 类固醇（如雌二醇），重构的“类固醇 17β-还原”路径在酵母中成功搭建，显示了其合成非天然甾体的强可塑性。
**关键酶工程突破**
综述指出，**P450 酶的定向进化**是解锁甾体特异性羟基化的钥匙。以 CYP21A2（催化孕酮 21-羟基化生成皮质酮前体）为例，经过三轮易错 PCR 及定点饱和突变筛选，其催化效率 (kcat/Km) 提高 23 倍，同时底物抑制现象几乎消失。类似地，人源 3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）通过同源建模和活性口袋重塑，在酵母中实现了可溶、高活性表达，解决了该酶长期困扰的包涵体难题。
**氧化还原平衡与能量代谢重塑**
综述强调，每合成一分子皮质醇，净消耗约 12 分子 NADPH，细胞原有的辅因子库极易被耗竭。通过强化磷酸戊糖途径并引入非氧化糖酵解（NOG）回路再生 NADPH，甾体氧化反应的转化率提升了 4~6 倍。同时，对丙酮酸脱氢酶旁路和乙酰辅酶 A 合成途径的改造，使 MVA 途径前体供应增加 3 倍以上，且不引发乙酸溢流等代谢负担。
**工业相关性质的可控调节**
针对酵母发酵中常见的泡沫生成、菌体絮凝及产物结晶等工艺难题，综述汇总了形态工程和产物结晶策略。例如，敲除絮凝基因 *FLO1* 获得均匀悬浮培养，使甾体产量在高密度发酵条件下再提高 40%。通过控制发酵液 pH 和甘油浓度，实现目标甾体在胞外特异性微结晶，显著降低了下游纯化成本。
四、讨论与展望
尽管酿酒酵母合成甾体已经取得长足进步，Jimoh 等人的综述仍清醒地指出了迈向工业化必须跨越的障碍，并勾勒出未来发展的方向。
**当前挑战**
首先，**复杂甾体的全合成途径仍然过长**，引入十余个异源基因后，细胞代谢负荷沉重，质粒不稳定与表达噪音等问题突出，亟需多拷贝染色体整合与人工染色体技术稳定遗传。其次，P450 电子传递链的不兼容仍是限速瓶颈，辅因子不平衡易造成活性氧泄漏，引发生长抑制。第三，甾体分子在酵母内的转运机制尚不明朗，大量产物滞留在内膜系统或脂滴中，导致实际可回收产量远低于理论值。最后，工业放大时发酵液的非均相特性（气-液-固三相）使得传质与流变学行为复杂化，在线过程检测手段不足。
**前沿方向展望**
综述预测，**计算与自动化**将加速途径设计与酶定向进化的“设计-构建-测试-学习”循环。机器学习的蛋白质表示模型可预测氨基酸替换对 P450 选择性的影响，极大压缩筛选库容。基因组规模代谢模型（GEM）与动态通量平衡分析将指导碳流精准再分布。新兴的**非经典酵母底盘**（如解脂耶氏酵母）因其更高乙酰辅酶A通量和疏水环境，或将成为甾体合成的有力补充。此外，**化学-酶法级联**与**光/电驱动辅因子再生**等无细胞混合系统，有望打破细胞内稳态的限制，实现超越自然极限的反应速率和产率。
Jimoh 等最后强调，酿酒酵母在甾体合成中的使命远未结束，合成生物学与代谢工程的深度融合，将促使这一古老的真核微生物真正演变为“甾体微型工厂”，为全球健康产业提供源源不断的绿色原料。
参考来源
> Jimoh S, Issa, Bale S, et al. Metabolic Engineering of *Saccharomyces cerevisiae* for Enhanced Steroid Biosynthesis: Advances, Strategies, and Industrial Implications[J]. Semantic Scholar, 2025. DOI: 10.33003/sajols-2025-0301-65.
DOI: 10.33003/sajols-2025-0301-65