来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
第二代生物乙醇的产业化进程长期受制于纤维素酶的高成本。本研究以甘蔗渣与麦麸为底物，在多层填充床生物反应器中以批式与连续两种模式培养嗜热毁丝霉，系统评估了内切葡聚糖酶从生产、提取、回收到稳定的全链条集成方案。连续操作在保持平均酶活不降的前提下显著提升了各模块间的空间均一性，硫酸铵沉淀法回收率达78.7%，为纤维素酶原位生产提供了一条可行的技术路径。
研究背景
循环生物经济主张将有机副产物转化为能源、生物材料和高附加值生物产品。木质纤维素生物精炼厂作为关键平台，整合了生物技术与物理化学转化路线。第二代生物乙醇的可行性高度依赖高效的纤维素酶系——这是木质纤维素生物质糖化步骤的核心投入。然而，商品酶制剂成本高昂，严重制约了生物乙醇的经济性。
原位纤维素酶生产被认为是降低对外部酶制剂依赖、提升生物精炼厂酶自给率的战略路径。固态发酵（SSF）因能直接利用农业工业副产物作底物、较液体发酵大幅减少用水、契合循环生物经济理念而受到关注。在多种反应器构型中，填充床系统因设计简单而颇具吸引力——但其传热不良、操作模式单一、下游处理困难等瓶颈，至今阻碍着固态发酵产酶的大规模工业化。如何在多层填充床中实现酶生产与提取回收的工艺集成，是当前研究的焦点。
研究方法
微生物与底物
产纤维素酶菌株采用嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）I-1D3b。该菌株最初分离自巴西Olímpia的Usina Guarani甘蔗渣堆，前期摇瓶与反应器实验已证实其纤维素酶生产能力。
接种物制备：将菌株接种于含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的锥形瓶中，在生化需氧量培养箱（BOD，型号SL 200，Solab，巴西）中于45 °C培养至少48 h，以完成菌丝生长与产孢。培养结束后，用100 mL无菌营养溶液轻轻刮取琼脂表面孢子。该营养溶液pH调至5.0，组成（w/v）为：0.35%（NH₄）₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化至每克干固体（g.d.s）含1 × 10⁷个孢子。
固态底物选用甘蔗渣（SCB）与麦麸（WB），二者成本低、区域供应充足，且能为固体基质提供有利的营养与结构条件。SCB由巴西Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.供应，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro，São Carlos，SP，巴西）。SCB先用对流烘箱（型号035，Marconi，巴西）在60 °C下干燥至含水量10–15%（水分分析仪测定，M5 Thermo，Bel Engineering，Monza，意大利）。干燥后分别过5 × 5 mm和4 × 2 mm孔径筛。麦麸直接使用，含水量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床生物反应器固态发酵
固态发酵实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，实现床层温度控制并缓解填充床SSF中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供给，依次通过针阀、生物过滤器和AppliTech®流量计（Asa，意大利），再进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间隙充满蒸馏水并保持操作温度，以在空气进入反应器前促进其饱和——该策略旨在尽量减少SSF过程中的床层过度干燥。反应器出口处，渗透气体通过由冷凝收集器与接收瓶组成的除湿系统，再经直径5.2 cm、高39 cm的硅胶柱。该装置将出口空气相对湿度降至15%以下，这是使用Vaisala Carbocap探头（Vantaa，芬兰）准确测量CO₂浓度的必要条件。
反应器垂直放置，包含入口模块（IL）和出口模块（OL），两者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部几何形状为锥形。操作时空气自下而上流过固定床。位于系统底部的入口模块填充玻璃珠以促进气流均匀分布，出口模块则保持空置以利于气体流动。另设两个辅助模块，分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）和干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块中水分的过度散失并吸收出口模块壁上冷凝的水分。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持在45 °C——这是M. thermophila生产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验期间，过程空气与循环水均通过模块和加湿器夹套中的水循环保持在45 °C（恒温水浴，型号SL-152，Solar，巴西），渗透空气流量固定为250 L h⁻¹，以增强氧传质并维持床层适宜的湿度条件。
发酵温度曲线用T型热电偶随时间监测，热电偶通过法兰安装在每个发酵模块的入口和出口处。传感器尖端位于各模块的径向中心，可全程监测床层内部温度演变。信号由National Instruments COMPAQ-DAQ数据采集系统记录，运行基于LabVIEW软件（National Instruments，Austin，USA）开发的自编程序。
模块的添加、移除和重新定位过程中，固体底物会短暂暴露于实验室环境。所有操作均在无菌条件下进行以尽量减少微生物污染。底物与营养溶液分别在121 °C高压灭菌20 min。冷却后，各组分与孢子悬浮液在经紫外线预灭菌的层流柜中混合均质。空气过滤器和加湿装置在每次发酵前也进行灭菌。
发酵培养基由SCB与WB以7:3（w/w）比例混合配制。含水量通过添加营养溶液和接种物悬浮液调至75%（湿基），接种量足以提供每克干固体1 × 10⁷个孢子。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为评估操作模式（批式与连续）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，连续操作又分为上向和下向两种方式。
批式培养中，PBB在发酵开始时即装配所有发酵模块，并保持相同构型直至96 h终点。该条件作为与连续模式实验比较的参照。4天发酵使用4个发酵模块，标记为L1、L2、L3、L4。
连续模式下，模块每24 h逐一添加，经过接种、装填和耦合步骤接入PBB。初始阶段床层高度逐渐增加，直至最先插入的模块达到指定停留时间。此后进入稳态操作，其特征为发酵成熟模块的取出与新接种模块的添加同步进行。模块运动方向取决于操作策略——上向模式（底部进料、顶部取出）或下向模式（顶部进料、底部取出）。
研究结果
填充床生物反应器中的固态发酵
发酵过程中的热行为
热调控是填充床生物反应器操作中的主要技术挑战之一——代谢热的积累可能损害酶稳定性与发酵过程均一性。本研究考察了批式与连续操作模式对M. thermophila I-1D3b在木质纤维素底物（SCB:WB = 7:3 w/w）上生产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3显示了批式操作（图3a）、上向连续操作（图3b）和下向连续操作（图3c）中4个发酵模块监测到的温度随时间演变。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度保持在45 °C附近，各监测点间差异小于4 °C。批式操作下，初始温度升高，随后出现热峰并趋于稳定或略微下降——这一行为与固定床系统中代谢热的瞬态积累一致。轴向热梯度的形成与单向通气内在相关，表现为温度沿反应器长度的离散分布。尽管过热程度较轻，但梯度的持续存在可能影响床层内的氧传质和蒸发速率。
连续操作下（图3b和c），热剖面比批式模式呈现更频繁的振荡，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在这些波动，温度仍保持在与批式操作相似的范围内，未观察到相关热过热的证据。在96至210 h之间，每24 h添加和移除一个模块，系统沿柱体逐级推进模块，其行为接近活塞流反应器。这与Mitchell等人的观点一致——连续PBB操作可能促进床层沿程工艺条件的更大均匀性。各操作模式的最大温度和平均温度相近：峰值温度分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上向连续）和47.8 ± 0.8 °C（下向连续），平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4和44.5 ± 0.5 °C，差异无统计学意义（p > 0.05）。结果表明，在所评估条件下，两种操作模式均使系统维持在接近目标热范围，无严重过热。
温度维持在接近最适范围的范围内，表明高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及所采用的模块移动策略共同促进了代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等人在含甘蔗渣和麦麸系统中报道的0.55——后者观察到约3 °C的温升。相比之下，Ghildyal等人在PBB中用黑曲霉培养于麦麸时报道了15 °C的温升。这些对比共同证实，床层的物理结构在固态发酵的热消散和热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置也影响反应器热剖面。图3c显示了新接种模块从反应器上部加入时连续发酵的热行为。在该构型中，温度峰值集中在PBB上部区域，与图3b中峰值出现在床层下部和中间区域的剖面形成对比。这一差异表明，新接种模块所占据的位置直接影响系统内热量的空间分布。图3c中每24 h记录到的温度下降反映了模块添加、移除和移动的时刻，表征了连续操作中的间歇性特征。由于新模块插入发酵区上部，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间热变化较小。这一行为说明模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，应在系统操作设计中予以考虑。然而，由于与下游系统集成相关的操作限制，本研究后续连续实验均采用上向模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
在批式和上向连续操作下评估了内切葡聚糖酶活性和发酵模块的最终含水量，结果如图4a和b及表1所示。这些变量的控制对PBB性能至关重要——水热梯度低于10%时酶生产率可能降低30–50%。批式与连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相近，分别为95.63 ± 28.37和96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相似，但连续过程中观察到的较低离散度表明各发酵模块间酶活的空间均一性更高。因此，两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性，而非平均酶产量水平。
连续操作下的这种均一性与批式模式中观察到的较大离散度形成对比——后者可归因于静态系统中局部水分、温度和氧可用性的异质性——从操作角度看，这代表了更高的过程稳健性和可预测性。这种更高的均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间暴露于热梯度和湿度梯度的所有区域。根据Mitchell等人的观点，连续操作下PBB趋于接近活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相和热条件。这些结果与Rodrigues等人报道一致——他们也观察到M. thermophila I-1D3b在PBB中连续发酵时内切葡聚糖酶活性的更高均一性。
除酶活外，床层含水量也是系统的关键方面——水分减少直接损害SSF中真菌生长和代谢活性。固体基质的最终含水量（湿基%，w.b.）列于表1。
CO₂浓度监测
批式与连续模式下出口气体流中的CO₂浓度曲线以双重复形式呈现。CO₂浓度的变化趋势为评估微生物代谢活性与发酵进程提供了补充信息。
连续操作下的酶提取与回收
在连续操作下，以180 L h⁻¹和2400 L h⁻¹两种渗透提取流量评估了各模块的内切葡聚糖酶活性和回收率。下标“E”表示渗透回收的酶活，无下标数值表示渗透后固体补充提取的残余酶活。提高渗透水流量显著增强了酶回收效果——这表明传质是下游性能的关键限制因素。
渗透提取循环中的酶活回收
对M. thermophila I-1D3b发酵底物（甘蔗渣:麦麸 = 7:3 w/w）进行连续渗透提取循环，每次循环回收的内切葡聚糖酶活性如图所示。柱形表示平均值±标准差（n = 3），不同字母表示Tukey检验差异显著（p < 0.05）。
下游浓缩与酶学性质
内切葡聚糖酶活性作为（a）硫酸铵饱和度和（b）乙醇浓度的函数被考察，同时测定了（c）60%和70%饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学曲线。硫酸铵沉淀性能优于乙醇，从粗提液中回收总酶活单位的78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在所评估条件下导致显著的酶活损失。酶学表征显示，最大酶活在60 °C和pH 4.0条件下获得，证实了该酶适用于工业应用的嗜热嗜酸特性。沉淀提取物表现出高热稳定性，在60 °C下孵育24 h后仍保留约92%的酶活。
讨论与解读
本研究系统证实了M. thermophila I-1D3b在多层填充床反应器中以批式和连续两种模式进行固态发酵产内切葡聚糖酶的技术可行性与可重复性。连续操作在不牺牲平均产量的前提下降低了床层内异质性，促进了各发酵模块间酶活的空间均一性。热剖面保持在物种最适范围附近——批式最高温48.2 °C、连续最高温48.9 °C——表明连续操作未损害系统稳定性。在浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优越，回收率达78.7%，酶活156 U·g.d.s⁻¹；乙醇则在测试条件下造成酶活净损失。沉淀提取物热稳定性高，60 °C孵育24 h后保留约92%活性。整体而言，热控制、渗透提取与下游处理的集成对平台在二代乙醇链中原位生产纤维素酶的稳健性与适用性至关重要。
编译者解读
该研究的技术价值在于把"发酵—提取—浓缩"三个通常割裂的单元整合进了同一个连续化框架——用模块移动策略同时解决了填充床散热和产物回收两个老问题。连续模式带来的均一性提升（标准差从±28.37降至±4.63 U·g.d.s⁻¹）对工业放大极具吸引力。硫酸铵沉淀78.7%的回收率与60 °C下92%的热稳定性也验证了嗜热酶在下游加工中的天然优势。不过，2400 L h⁻¹的渗透流量在工业尺度上的水耗与废水处理成本仍需审慎评估；乙醇沉淀的失败也提示，有机溶剂路线在该体系中的适用性有限，值得进一步优化沉淀条件而非简单放弃。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. Bioprocess Biosyst Eng. PMID: 42370983.
PMID: 42370983