来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导语：丙酮黑色素（pyomelanin）应用广泛，但天然菌株产量低。华东理工大学研究团队以甲醇为碳源，通过工程化Komagataella phaffii（即毕赤酵母）平衡三条生物合成模块，使尿黑酸（homogentisic acid, HGA）产量提升66倍，并经氧化聚合合成丙酮黑色素。5-L发酵罐高密度发酵204小时后，工程菌株Pyo29实现70.5 ± 0.7 g/L的最高产量，为工业化生产提供了可行方案。
研究背景
丙酮黑色素是一类天然黑色素，在光电子材料、生物医学、环境修复等领域应用广泛。然而，从天然产生菌中直接提取，产量极低，难以满足工业需求。微生物工程合成被视为可持续且经济可行的替代路线。
K. phaffii（原Pichia pastoris）是一种成熟的甲醇营养型工业宿主，具备完善的蛋白表达系统和翻译后修饰能力，且能以甲醇为唯一碳源生长。甲醇来源广泛、价格低廉，是理想的工业原料。该菌株天然具备尿黑酸合成途径——尿黑酸是丙酮黑色素的前体，经氧化聚合即可生成目标产物。
但野生型菌株的尿黑酸产量仅有25 ± 0.85 mg/L，远不足以支撑工业化生产。瓶颈在于催化L-酪氨酸转化为尿黑酸的关键酶——羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）和酪氨酸转氨酶（TYRB）催化效率低。如何突破这一瓶颈，成为整个研究的核心问题。
研究方法
菌株与载体系统：研究以K. phaffii GS115（Invitrogen）为宿主菌，E. coli TOP10F'（Invitrogen）用于质粒构建与扩增，E. coli BL21(DE3)（Sangon Biotech）用于蛋白表达。考虑到基因稳定性，采用pZACH质粒进行基因过表达整合，并用Cre/loxP ZeoR标记循环回收方法确保每次整合的遗传稳定性。基因敲除使用pENO1-Cas9质粒以避免脱靶效应。蛋白表达与纯化使用pET-28a质粒。异源酪氨酸转氨酶（TYRB）和羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）基因经密码子优化后由Generay（上海）合成。
培养基与培养条件：所有E. coli菌株在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37 °C培养。重组酵母菌株分别在YPD培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨）、BMGY培养基（1%酵母提取物、1.34% YNB、2%蛋白胨、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甘油）或BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.1 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1%甲醇）中培养。
HGA生物合成途径构建：首先测试野生型菌株的HGA生产能力——摇瓶发酵5天后，HGA产量为25 ± 0.85 mg/L，上清液无明显颜色变化，OD400仅为0.006。随后向培养基中补充不同浓度的L-酪氨酸，但HGA产量未见显著提升，说明内源HPPD和TYRB催化效率低下。
研究团队转而筛选不同来源的HPPD和TYRB基因，最终确定来自Alcaligenes faecalis的HPPD（AfHPPD）和来自Yarrowia lipolytica的TYRB（YlTYRB）为候选基因。与TYRB相比，HPPD过表达对HGA产量的提升效果更显著，印证了文献中HPPD是HGA生物合成途径关键酶的结论。
多拷贝整合是提高目标产物产量的有效策略。研究团队通过将AfHPPD整合至基因组不同位点（HIS4、INT1、INT18）实现多拷贝表达。携带三个AfHPPD拷贝的菌株Pyo9，HGA产量达到64.1 ± 0.68 mg/L，上清液呈浅棕色，OD400升至0.362——这归因于HGA的自氧化聚合。
三条模块的平衡：论文摘要指出，通过平衡三条不同的生物合成模块，HGA产量最终提升66倍。原文摘要未详述三条模块的具体划分与平衡策略细节，但结合合成生物学常规策略推断，可能涉及前体供应模块、核心合成模块和辅因子再生模块的系统性优化。
颜色筛选系统与定向进化：研究建立了丙酮黑色素颜色筛选系统，并应用于3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHPS）的定向进化，以及羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）的半理性设计改造。颜色筛选系统的原理在于——HGA自氧化聚合产生深色色素，菌落或培养液颜色深浅直接反映HGA产量高低，从而实现了高通量筛选。原文摘要未详述DAHPS定向进化的具体突变策略、文库大小及筛选通量等参数。
丙酮黑色素的氧化聚合：研究比较了碱性条件下氧化聚合与漆酶（laccase）处理两种聚合路径的差异。原文摘要未详述两种聚合方式的具体反应条件（如pH、温度、酶用量、反应时间等）。
高密度发酵：在5-L发酵罐中进行高密度发酵，总时长204小时。原文摘要未详述发酵过程中的具体参数——包括甲醇流加策略、溶氧控制范围、pH调控区间、温度设定等。
研究结果
HGA产量提升66倍：通过平衡三条生物合成模块，HGA产量较野生型提升66倍。这是整个研究的核心突破——从野生型的25 ± 0.85 mg/L起步，经多拷贝整合、模块平衡和酶工程改造，最终实现产量的大幅跃升。
关键酶改造效果显著：颜色筛选系统成功应用于DAHPS的定向进化和HPPD的半理性设计。HPPD被确认为HGA生物合成途径的关键酶——过表达AfHPPD对HGA产量的提升效果明显优于过表达YlTYRB。三拷贝整合的菌株Pyo9（整合位点HIS4、INT1、INT18）HGA产量达64.1 ± 0.68 mg/L，较野生型提升约2.5倍。
两种聚合路径的差异：研究首次报道了碱性条件下氧化聚合与漆酶处理所得丙酮黑色素的结构差异。原文摘要未提供两种聚合产物的具体表征数据（如分子量分布、官能团差异、紫外-可见光谱特征等），也未详述差异的具体表现。
5-L发酵罐最高产量：经过204小时高密度发酵，工程菌株Pyo29实现70.5 ± 0.7 g/L的丙酮黑色素最高产量。这是目前报道的丙酮黑色素微生物合成最高水平之一。从摇瓶到发酵罐的放大过程中，产量实现了从毫克级到克级的跨越。
应用价值验证：研究最终证明了丙酮黑色素的潜在应用价值。原文摘要未详述具体应用场景及性能测试结果——涉及何种应用领域、性能指标如何，均未在摘要中展开。
讨论与展望
这项研究的价值在于打通了"甲醇→尿黑酸→丙酮黑色素"的完整生物合成链条。甲醇作为碳源的选择颇具工业眼光——来源广泛、价格低廉、不与粮食争地。66倍的产量提升说明，模块平衡策略在真核宿主中同样有效。
颜色筛选系统的建立是一个亮点。利用HGA自氧化聚合产生色素的天然属性，将产量与颜色直接挂钩，实现了低成本、高通量的筛选——这比传统的色谱检测方法更适用于突变体文库的筛选。
碱性聚合与漆酶聚合的差异值得玩味。这一发现提示，丙酮黑色素的结构并非固定不变，而是可以通过聚合条件进行调控。如果后续研究能阐明两种聚合路径的产物结构差异及其对材料性能的影响，将为丙酮黑色素的定制化生产铺平道路。
70.5 ± 0.7 g/L的产量已具备工业吸引力。但发酵204小时的周期偏长，如何缩短发酵时间、提高时空产率，可能是下一步优化的方向。此外，原文摘要未提及丙酮黑色素的提取纯化工艺——从发酵液中高效回收目标产物，同样是工业化路上必须解决的问题。
参考来源
Zhu X, Lin J, Liang S, Qiu C, Jiang Y. Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations. Nature Communications. PMID: 41839868.
PMID: 41839868