来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
嗜碱芽孢杆菌 *Bacillus* sp. N16-5 是极具工业应用潜力的底盘微生物，其能在高 pH 条件下高效利用多种碳源，但长期缺乏精准、高效的基因组编辑工具，严重制约了代谢工程改造。本研究首次在该菌中成功构建了一套基于 CRISPR/Cas9 的高效无标记基因组编辑系统，利用温敏型质粒与反向筛选标记实现编辑质粒的快速消除，单基因敲除效率接近 100%。基于该平台，作者进一步理性重塑了木糖代谢途径，构建的工程菌株能够高效将木糖转化为光学纯度高达 99.9% 的 D-乳酸，为利用碱性环境下的木质纤维素水解液生产高值化学品开辟了新路径。
研究背景
木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，其水解液中含有大量葡萄糖和木糖。将木糖高效转化为高值平台化合物，如用于合成生物可降解塑料聚乳酸的 D-乳酸，是生物炼制领域的核心目标之一。然而，大多数工业微生物偏好酸性或中性环境，在进行纤维素水解液发酵时，往往需要大量中和剂来维持 pH，增加了下游分离成本。嗜碱微生物能够在高 pH 下直接发酵碱性预处理的水解液，具有突出的抗污染和过程经济优势。
*Bacillus* sp. N16-5 是一株分离自内蒙古碱湖的兼性嗜碱菌，最适生长 pH 约为 9.0，能够利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等多种单糖，并且已建立成熟的遗传转化体系，具备了作为新一代碱性底盘细胞的优良禀赋。然而，针对该菌的基因组编辑手段十分有限，早期依赖非复制型质粒的同源重组效率极低，严重拖慢了代谢工程改造的步伐。CRISPR/Cas9 系统以其设计简便、编辑高效、可多重迭代等优势，已成为多种芽孢杆菌遗传改造的利器，但在嗜碱芽孢杆菌中，由于细胞内环境差异（如高 pH、离子强度）以及外源 Cas9 蛋白的毒性作用，尚无成功应用的报道。因此，开发适用于 N16-5 的高效 CRISPR/Cas9 编辑系统，不仅是方法学上的突破，更是释放该菌底盘潜能的关键一步。
研究方法
研究团队围绕“高效编辑”与“快速质粒消除”两大目标，采取了一系列巧妙的分子设计。首先，他们对化脓链球菌 Cas9 基因进行了针对 *Bacillus* 的密码子优化，并将其置于组成型强启动子 P43 的控制之下，以保证 Cas9 蛋白在嗜碱条件下的稳定表达。为了精确调控 sgRNA 的转录，采用了改造后的强组成型启动子，确保引导 RNA 的丰度足够驱动 Cas9 的靶向切割。在此基础上，通过同尾酶拼接，将 Cas9 表达盒、sgRNA 表达框以及同源修复模板共同整合至一载体中，构建出全功能编辑质粒 pSS-Cas9。
为解决编辑后质粒难以消除的共性难题，该载体骨架中引入两个关键元件：一是温敏型复制子 pE194ts，在高于 45°C 时质粒复制停止，从而实现温度诱导的质粒丢失；二是反选标记基因 *pheS*\*，其编码的苯丙氨酰-tRNA 合成酶突变体可将对氯苯丙氨酸（pCl-Phe）掺入蛋白，导致细胞致死。通过向平板中添加 pCl-Phe，可高效反向筛选出已经丢失编辑质粒的重组子。同源修复模板的设计也经过精细优化，臂长被确立为 500–1000 bp，以平衡重组效率与引物合成便利性。在转化环节，系统比较了电穿孔法在不同电场强度、质粒浓度和细胞生长期下的效果，最终确定在 OD₆₀₀ 为 0.5–0.6 收集细胞、以 2.0 kV 电压进行电击，可获得最高的转化效率，突破了嗜碱菌厚细胞壁的限制。
在应用部分，为实现木糖利用与 D-乳酸合成，研究者设计了多重基因操作路线：其一，将来源于凝结芽孢杆菌的木糖异构酶基因 *xylA* 和木酮糖激酶基因 *xylB* 以操纵子形式整合至基因组的高表达位点，强化木糖进入磷酸戊糖途径的代谢通量；其二，精准敲除内源的 L-乳酸脱氢酶基因 *ldhL*，阻断 L-乳酸生成；其三，在同一操纵子下游引入来源于凝结芽孢杆菌的 D-乳酸脱氢酶基因 *ldhD*，引导碳流专一性流向 D-乳酸。通过连续的编辑-消除循环，最终获得了多基因组合修饰的工程菌株。
研究结果
基于 pSS-Cas9 的基因组编辑系统在 *Bacillus* sp. N16-5 中展现出极高的编辑效率。以尿嘧啶磷酸核糖转移酶编码基因 *upp* 为报告靶点，当同源臂长度为 500 bp 时，所有受测转化子均成功发生目标缺失，编辑效率达到 100%；即使臂长缩短至 100 bp，效率仍维持在 85% 以上。编辑后的质粒消除在 48 小时内即可完成，通过温度切换与 pCl-Phe 反选，成功获得了无质粒残留、无抗生素抗性标记的纯净重组菌株。全基因组重测序证实，编辑过程未引入非目标突变，显示出高度特异性。
利用该编辑工具，研究团队高效完成了木糖利用途径的工程化重构。构建的终菌株 *Bacillus* sp. SEB4 的木糖消耗速率较野生型提升了近 3 倍。在摇瓶发酵中，以 50 g/L 木糖为唯一碳源，该菌株静置培养 48 小时后，D-乳酸积累量达到 45.5 g/L，糖酸转化率为 0.89 g/g，达到理论转化率的 89%。更为突出的是，产物光学纯度经过手性柱高效液相色谱检测，D-乳酸对映体过量值超过 99.9%，这得益于 *ldhL* 的干净敲除与 *ldhD* 的特异性催化。在真实生物质水解液评价中，以玉米芯稀酸水解液（含约 35 g/L 木糖和 15 g/L 葡萄糖）为底物，无需额外灭菌或 pH 调节（
DOI: 10.1111/1751-7915.14131