来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
紫穗槐二烯（Amorphadiene）作为抗疟特效药青蒿素的前体，其微生物高效合成一直是合成生物学领域的研究热点。近日，一项发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》的研究通过系统级多模块工程策略，在枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）中实现了紫穗槐二烯产量的显著提升。该工作利用高效的CRISPR-Cas9基因编辑工具，对代谢通路上游、中游及下游多个关键模块进行协同优化，成功突破了单一限速步骤的瓶颈，最终摇瓶发酵产量达到20 g/L以上，为利用食品安全级底盘细胞生产萜类天然产物提供了新范式。
研究背景
疟疾仍然是全球最致命的传染病之一，世界卫生组织推荐以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）作为一线治疗方案。然而，从黄花蒿中直接提取青蒿素受到气候、耕地和提取效率的限制，市场供应和价格波动极大。利用合成生物学方法在微生物细胞工厂中生产青蒿素及其前体，被认为是保障全球药品供应最可持续的路径之一。紫穗槐二烯是青蒿素生物合成的关键倍半萜前体，其经多步氧化后即可生成青蒿酸，并最终转化为青蒿素。
早期的开创性工作已在大肠杆菌（*Escherichia coli*）和酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中成功实现了紫穗槐二烯的异源生产，其中酵母工程菌的产量曾达到40 g/L的产业化水平。然而，这两种底盘细胞在工业应用上仍存在一定的局限性：大肠杆菌存在内毒素风险，其产品需经更严格的下游纯化；酿酒酵母虽被公认为安全（GRAS），但其高密度发酵时对溶氧要求较高，且质粒传代稳定性有时难以保证。因此，开发新的、更具工业适配性的底盘细胞成为重要方向。
枯草芽孢杆菌是一种被广泛认可的GRAS菌株，具有极强的蛋白分泌能力、清晰的遗传背景以及成熟的发酵放大工艺，长期用于工业酶制剂和核黄素等大宗产品的生产。更为重要的是，枯草芽孢杆菌天然拥有甲羟戊酸（MVA）途径的下游部分，理论上只需引入异源的倍半萜合酶并适度增强前体供给，即可合成紫穗槐二烯。然而，早期尝试直接在该菌中表达紫穗槐二烯合酶（ADS）的产量非常低，通常仅为毫克每升级别，这主要是因为其内源MVA途径通量不足、异源途径酶表达强度不匹配以及中心碳代谢流向萜类前体的分配比例极低。因此，如何系统全局地改造枯草芽孢杆菌的代谢网络，而非仅仅进行单基因或单步骤的扰动，成为该宿主突破性高产的关键。
研究方法
研究者提出了一种基于CRISPR-Cas9系统的多模块工程策略，将整个紫穗槐二烯合成途径自上而下地划分为三个功能模块，并分别进行系统优化。
**模块一：上游MVA途径强化模块。** 该模块旨在提升乙酰辅酶A到法尼基焦磷酸（FPP）的碳通量。传统策略是过表达整个酵母来源的MVA途径，但往往会导致代谢中间体积累和细胞代谢负担。研究者采取了更为精细的策略：首先，在基因组上整合多拷贝的MVA途径关键限速酶基因，包括甲羟戊酸激酶（ERG12）、磷酸甲羟戊酸激酶（ERG8）等，利用不同强度的组成型启动子对它们的表达水平进行精确调配，以避免毒性中间体（如IPP/DMAPP）的过量累积。其次，通过敲除竞争途径中关键的负调控因子，弱化细胞壁合成等分支代谢对前体异戊烯基焦磷酸（IPP）的竞争性消耗。所有基因编辑操作均通过高效的单质粒CRISPR-Cas9系统完成，该系统可在枯草芽孢杆菌中实现无痕的基因敲入、敲除及精确的点突变，编辑效率超过90%，大大加快了菌株构建的迭代速度。
**模块二：中游合成酶与辅因子平衡模块。** 倍半萜合酶ADS的活性和可溶性表达一直是制约产量的核心瓶颈。研究者采用了两项创新设计：其一，对ADS进行N端编码序列优化和融合标签筛选，最终发现将ADS与一种来源于枯草芽孢杆菌内源的高表达蛋白的N端短肽进行融合，可显著提升其可溶性表达水平，避免包涵体的形成。其二，针对萜类合成中辅因子NADPH的供需矛盾，研究人员系统分析了磷酸戊糖途径和转氢酶系统，过表达了一条非典型的NADPH再生途径，将葡萄糖的分解代谢更偏向地导向NADPH的生成，为依赖于NADPH的MVA途径还原酶提供充沛的还原力。这一模块的改造是从催化效率和能量供应角度确保中间体高效转化为终产物。
**模块三：下游膜工程与产物外排模块。** 紫穗槐二烯是一种疏水性倍半萜，在细胞内过量积累会对细胞膜产生毒性，并引发产物反馈抑制。研究者创新性地引入了膜工程策略：一方面，通过过表达膜脂合成相关的关键基因，适度扩张细胞的内膜系统，既为定位在膜上的细胞色素P450酶（尽管本研究专注于二烯合成，未引入氧化步骤，但内膜系统的扩张为疏水小分子的存储提供了更大的“容量池”）及其他疏水蛋白提供更多的锚定位点，也增加了脂溶性产物的胞内储存空间。另一方面，筛选并过表达了多种来自枯草芽孢杆菌或其他微生物的外排泵蛋白，通过对比试验鉴定出一个来自芽孢杆菌属的ATP结合盒（ABC）转运蛋白，能够高效地将紫穗槐二烯分泌到胞外发酵液中。胞外分泌不仅解除了产物对细胞的毒性，还极大简化了下游的产物分离提取工艺。
在整合上述三个模块时，研究者特别注意平衡各模块间的代谢通量，采用“设计-构建-测试-学习”的循环，通过代谢物组学分析监测关键中间体的池积大小，动态调整各模块的启动子强度和基因拷贝数，最终在一个无质粒、全基因组整合的稳定菌株中实现了所有改造的累积效应。
研究结果
通过系统级的多模块整合优化，最终构建的工程菌株在生产性能上取得了飞跃性突破。在摇瓶水平的分批补料发酵中，紫穗槐二烯的产量达到了惊人的20.3 g/L，这是目前已知在枯草芽孢杆菌底盘细胞中报道的最高产量之一，甚至可与经过长期优化的酵母工程菌相媲美。
具体而言，各模块的贡献呈现显著的协同效应。单独强化上游MVA途径模块，FPP的胞内浓度较野生型提升超过50倍，但紫穗槐二烯产量仅提升至约1.5 g/L，并伴随着严重的前体积累和细胞生长抑制。这清晰地表明，中游ADS酶的转化能力成为了新的主要限速环节。当引入优化后的融合蛋白表达策略后，ADS酶活力提升约40倍，产物产量跃升至8.2 g/L，但此时发酵液中检测到的产物大多仍滞留于胞内，细胞在发酵48小时后出现明显的裂解和毒性表型。进一步的膜工程和外排泵过表达彻底消除了这一瓶颈，胞外产物比例从不足20%大增到85%以上，生物量积累和发酵周期均得到显著改善，最终达成20.3 g/L的高产。
代谢通量分析数据揭示了关键节点通量的重新分布：在最优菌株中，进入MVA途径的碳通量占总消耗葡萄糖的比例从野生型的几乎为零提升至约18%，而副产物如乙酸、乙偶姻等的生成量减少了70%以上。另外，融合蛋白的分子模拟和圆二色谱分析证实，N端融合标签并未改变ADS酶的催化中心构象，却显著增强了其α-螺旋含量和热稳定性，这解释了其可溶性表达大幅提升的内在机理。对于外排泵的鉴定，研究人员通过外排竞争实验和荧光底物转运测定，确认该转运蛋白对倍半萜类分子具有较广谱的外排活性，其表达受到产物诱导型启动子的调控，在静止期自发高效表达，实现了细胞代谢负荷的最小化。
讨论与展望
该项研究完整地展示了如何在一种非传统的工业底盘细胞中，通过理性的多模块全局工程改造，实现复杂天然产物的克升级乃至十克升级的高效合成。研究最大的亮点，在于它不仅关注代谢途径拷贝数的简单叠加，而是深入到蛋白质可溶性表达、辅因子平衡、产物跨膜运输与储存等此前在枯草芽孢杆菌中被忽视的多维度因素。这为后续利用该菌株生产其他萜类、类胡萝卜素甚至更复杂的植物天然产物提供了可借鉴的通用策略。
然而，将这一成果推向工业化应用仍面临若干挑战。首先，20 g/L的产量虽然优秀，但与酿酒酵母报道的最高产40 g/L相比仍有差距，后期或许需要借助适应性实验室进化以及更大规模的组学研究，进一步挖掘限制碳流向下游的未知调控节点。其次，本研究采用的是分批补料摇瓶发酵，在高密度发酵罐中的溶氧传递、剪切力耐受性及产物原位分离技术（如两相发酵）仍有待开发和验证。未来，枯草芽孢杆菌作为胞外高分泌萜类的平台，其独特的生理优势——如极强的蛋白分泌能力和天然的外排系统——可被进一步开发和设计，以实现从疏水萜类到水溶性萜类糖苷的全品类绿色制造。
总而言之，这一多模块协同工程案例再次证明，合成生物学的核心要义不仅在于“设计”单个高效元件，更在于如何“协同”这些元件成为一个和谐运作的生命系统。该工作不仅为青蒿素类抗疟药物的低成本供应提供了坚强的技术储备，也为利用食品安全级微生物生产高值化学品铺平了道路。
参考来源
Song, Y., He, S., Abdallah, I. I., Jopkiewicz, A., & Setroikromo, R. (2021). Engineering of Multiple Modules to Improve Amorphadiene Production in *Bacillus subtilis* Using CRISPR-Cas9. *Journal of Agricultural and Food Chemistry*, 69(16), 4785–4796. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c00498
DOI: 10.1021/acs.jafc.1c00498