来源：Plants (Basel) | 编译：DNA Lab Space
人参皂苷Rg1是人参属植物中最重要的药理活性成分之一，具有神经保护、抗衰老、抗炎等多种生物活性，其生物合成途径的解析一直是天然产物研究领域的热点。本研究通过多组学联合分析与基因共表达网络，系统鉴定了参与Rg1生物合成的候选基因，并通过异源表达与酶活测定验证了关键基因的功能，为阐明Rg1生物合成调控机制及实现其异源生产提供了重要理论依据。
研究背景
人参皂苷属于三萜类皂苷，主要来源于甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径提供的前体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。这些前体在法尼基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）的催化下生成2,3-氧化鲨烯，随后经过环化、羟基化、糖基化等一系列酶促反应，最终形成结构多样的皂苷分子。其中，Rg1属于达玛烷型四环三萜皂苷，其C-3位和C-6位分别连接葡萄糖基，C-20位存在羟基。尽管上游的鲨烯合成途径已经较为清晰，但从达玛烯二醇到Rg1的多步氧化、糖基化修饰过程仍存在大量未鉴定的酶，尤其是负责C-6位羟基化及后续糖基转移的关键酶基因尚未被系统解析。
传统上，人参皂苷生物合成基因的发掘主要依赖转录组测序结合差异表达分析，但单一方法往往受限于样品异质性、基因冗余和表达噪音。近年来，随着人参基因组和多个组织转录组的公布，利用系统生物学方法进行全基因组范围的候选基因筛选成为可能。本研究正是基于这一思路，整合基因组、转录组和代谢组数据，对人参中参与Rg1生物合成的全部候选基因进行了系统挖掘、分类和实验验证，旨在填补从中间体到终产物之间的酶学空白。
研究方法
研究首先从已公布的人参基因组中提取了全部基因模型，并通过与已知植物三萜皂苷生物合成酶（如细胞色素P450、糖基转移酶UGT、氧化鲨烯环化酶OSC等）的序列比对，建立了候选基因库。随后，研究人员利用不同组织（根、茎、叶、花）和不同发育阶段的转录组数据，计算了每个候选基因的表达量，并结合Rg1在不同样品中的含量测定结果，开展了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。通过构建共表达模块，筛选出与Rg1积累呈显著正相关的核心模块，并从中锁定了一系列候选基因。
在基因功能验证阶段，研究者选取了在根中高表达且与Rg1含量高度正相关的多个候选基因进行了全长cDNA克隆。这些候选基因分别编码细胞色素P450单加氧酶（如CYP716A亚家族成员）和UDP依赖性糖基转移酶（UGT）。研究者将候选基因构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的瞬时转化法在烟草叶片中进行异源表达，并以达玛烯二醇或原人参二醇等底物进行饲喂实验。转化后的烟草叶片经提取、水解后，利用LC-MS/MS检测是否存在羟基化或糖基化产物。对于表现出催化活性的酶，进一步在大肠杆菌或酵母中表达重组蛋白，进行体外酶动力学分析，以确定底物特异性、Km和Kcat等参数。
此外，研究者还对关键基因的启动子区域进行了顺式作用元件分析，通过qRT-PCR验证了其在不同组织和诱导条件下的表达模式，并结合亚细胞定位实验明确了酶在细胞内的分布位置。多层面的分析相互印证，构建了从基因到蛋白再到代谢产物的完整证据链。
研究结果
通过系统筛选，共鉴定出涉及Rg1生物合成的候选基因58个，其中包括编码氧化鲨烯环化酶的基因座3个、细胞色素P450基因29个、糖基转移酶基因21个以及参与辅基合成和转运的相关基因5个。WGCNA分析显示，有7个基因与Rg1积累量的相关系数超过0.85，其中两个P450基因（命名为PgCYP1和PgCYP2）和一个UGT基因（命名为PgUGT1）在根中的表达量显著高于其他组织，且与Rg1含量呈强正相关（r > 0.9）。
在烟草瞬时表达实验中，转入PgCYP1的叶片在饲喂达玛烯二醇后，检测到新产生的峰，其分子量与保留时间与标准品原人参二醇一致，表明PgCYP1具有催化达玛烯二醇C-12位羟基化的活性。而PgCYP2则能将原人参二醇进一步转化，生成在C-6位发生羟基化的产物，即原人参三醇，这是Rg1结构中C-6位糖基化所必需的前体。这一发现首次明确了人参中催化C-6位羟基化的P450酶，是Rg1生物合成通路中的关键限速步骤。
对PgUGT1的功能分析表明，该酶能够以UDP-葡萄糖为供体，特异性催化原人参三醇的C-3位和C-6位糖基化，生成Rg1的直接前体——三七皂苷R1或进一步转化为Rg1。体外酶学实验显示PgUGT1对原人参三醇的Km值为32.4 μM，催化效率为2.8×10⁻³ s⁻¹·μM⁻¹，呈典型的Michaelis-Menten动力学特征。亚细胞定位显示PgUGT1定位于细胞质和质膜附近，与P450酶在内质网上的定位形成空间耦合，支持多酶复合物的存在。
进一步对关键基因的启动子分析发现，PgCYP2和PgUGT1的启动子区域含有多个茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件和干旱胁迫元件，qRT-PCR结果也证实这些基因在MeJA处理后表达量上调3～6倍，与Rg1含量在胁迫条件下的积累趋势一致。综合以上结果，研究明确了一条从达玛烯二醇到Rg1的完整催化路径：达玛烯二醇 →（PgCYP1）→ 原人参二醇 →（PgCYP2）→ 原人参三醇 →（PgUGT1）→ Rg1。
讨论与展望
本研究通过全基因组水平的系统分析，突破了以往单一转录组筛选的局限，揭示了人参皂苷Rg1生物合成中多个未表征的酶学步骤，特别是首次证实了C-6位羟基化P450的生物学功能。这一发现不仅补齐了Rg1生物合成途经的关键缺口，还为其他达玛烷型皂苷（如Rb1、Rd等）的生物合成研究提供了借鉴。值得注意的是，虽然PgCYP2在体外和烟草中显示出C-6羟化活性，但其体内真正底物是否包括其他中间体、能否与多个UGT协同作用，仍需通过基因编辑或稳定转化实验进一步确认。
此外，研究采用的多组学共表达策略展示了在非模式药用植物中高效挖掘功能基因的可行性。未来，将这些关键基因导入酵母或烟草等底盘生物中进行多基因级联表达，有望实现Rg1的异源从头合成，从而解决野生人参资源枯竭和栽培周期长的问题。该研究同时也为其他复杂天然产物生物合成基因的发现提供了方法论参考。
参考来源
Liu R, Wang D, Jin G, Li L, Wang C. Comprehensive Candidate Gene for Ginsenoside Rg1 Biosynthesis: Identification, Systematic Analysis, and Verification. Plants (Basel). DOI: 10.3390/plantsXXXXXXX.